一般来说生物体内基因表达水平恒定（本底表达），响应外界压力时，基因表达水平才会发生显著变化。
我们常说的基因过表达是相对于本底水平的基因表达水平显著升高。这种升高背后往往潜藏着基因功能的秘密，因此我们时常想要通过人为提高基因表达水平，观察宿主细胞功能变化，来确定特定基因功能。最早基因过表达功能的探索来源于 1959 年一项对非整倍体基因组的研究，该项研究证实非整倍体基因和人类遗传病症状有关。其他基因过表达原因包括转录水平提高、基因甲基化程度改变或是染色体结构变化等，共同点都是下游蛋白质水平升高（非编码基因体现在RNA水平升高），检测方法一般是qPCR（RNA）和 western blot（蛋白质）。和自然界存在的突变类似，人为提高基因表达水平的思路有两个，分别是提高宿主基因拷贝数和增强基因本底表达水平。
前者我们可以通过质粒或病毒等载体外源转入目的基因或基因表达调控元件，直接或间接增加宿主的基因拷贝数，提高基因表达水平。
后者则是通过一些化学或大分子诱导剂，模拟环境压力，提高基因的表达水平。但这种方式对于基因表达的调控是整体性的，难以限定在个体基因水平。由于我们在实践中经常需要研究与特定基因过表达相关的功能，这里主要介绍前一种基因过表达方式。
直接增加基因拷贝数的方法一般通过载体外源转入目的基因序列和必须的基因表达调控元件（启动子等）就能实现。
间接方法则是外源转入转录因子等基因调控相关蛋白，增强宿主基因本底表达水平。一个常见例子是转入 dCas 和 VP64 融合蛋白，在 gRNA 的介导下，定向增强特定基因的转录水平（相关技术的细节和迭代将在下期推文中为大家介绍）。相关技术也很成熟，很多技术服务公司都可以做。基因过表达顾名思义指基因相对本底水平的显著提高。大量研究借助基因过表达相关技术揭示了基因功能和下游调控机制。
从最早在野生型背景下表达野生型基因开始，我们已经开拓了丰富过基因表达技术应用领域。
既可以在野生型背景下过表达野生型基因，直接研究基因的功能；也可以在突变型背景下过表达野生型基因，通过表型变化间接研究基因功能。当然，由于基因碱基含量一般较大，给下游分子克隆和递送载体提出很高要求。目前大规模基因功能筛选已经被更为简便的基因沉默技术替代。然而，基因表达在基因功能研究中依然不可替代，最直接体现在基因功能下游机制研究。基因表达的下游功能影响核心在于改变原有的生物化学平衡，根据作用结果可以分为抑制和激活两类。最直接的抑制方式是通过影响其他蛋白转录、翻译或降解，直接影响下游蛋白水平。比如 SMURF2 ubiquitin E3 的过表达可以通过泛素降解途径显著减少 KLF5 DNA-binding protein 水平。此外，如果过表达基因产物本身属于蛋白复合体或能够结合形成蛋白复合体，过表达产物还能通过竞争结合活性结合位点，影响下游通路中间产物含量，进而抑制影响整个通路的功能。研究发现，单独过表达 histone H2A/H2B 或 H3/H4 都会导致染色体分离异常。而同时过表达全部四种组蛋白则能回复正常。最后，除了竞争结合机制，如果过表达基因产物属于激酶类蛋白，其还能通过翻译后修饰等，抑制其他蛋白间相互作用。例如，stress-activated kinase ，Srk1 过表达能够导致 Cdc25 蛋白磷酸化失活，从而导致细胞 G2 期劫持。激活作用也是一样。如果过表达基因产物原本在通路中沉默或低水平表达，过表达后，相应通路就能被激活。研究发现，在成纤维细胞中过表达 MyoD 会激活分化相关通路，使细胞分化为肌肉细胞。此外，如果过表达基因产物能和抑制因子或作为激酶修饰相互作用的蛋白，就能直接激活相应通路功能。相关例子有 Ras-MAPK 通路中的蛋白过表达能够激活雌激素（estrogen） 受体转录活性。基因过表达时我们不仅需要注意基因本身，还需要考虑基因翻译蛋白的性质。基因功能是过表达时需要首先考虑的问题，一些毒性基因或自杀基因过表达能够显著影响宿主活性，影响表达效率。此外抗病毒基因只能采用质粒方式递送。基因负载也是考虑的问题。尤其在外源基因过表达时，不同递送载体的外源基因负载量具有固定限制，超出负载量时容易导致过表达失败。此外，外源基因 GC 含量、重复片段和多聚碱基都对基因合成和后期测序具有不同程度的影响。目前技术条件下的基因过表达水平仍有一定限度。一般宿主本底本底表达水平高的基因即使外源导入也很难达到引发功能变化阈值要求，事先了解表达宿主目的基因的本底表达水平依然很有必要。过表达效率的评估一般包括转录水平和蛋白水平，只是用 qPCR 检测到外源基因转录的 RNA 并不能证明过表达的基因与功能变化直接相关。很多时候我们还需用 WB 检测目的基因确实翻译成了蛋白质并引起蛋白水平的显著变化。因此了解基因编码蛋白的性质也很关键。不同宿主系统表达的蛋白结构存在差异。相比于原核表达系统，真核表达系统蛋白具有更复杂的翻译后修饰，活性更高，但相应成本更高，产量相对较小。对于不同细胞定位的蛋白（如跨膜蛋白和核蛋白等），我们还需调整 WB 实验前蛋白提取方法，增加对于蛋白的富集。Uniport 网站查询蛋白时可以获知蛋白翻译后修饰的信息。（上图示例为 Hepatocyte growth factor, ID：Q08048。该蛋白 N 端 1-32 号氨基酸为信号肽，具有 α 和 β 两条链）
最后，过表达蛋白的翻译后修饰如前导肽、信号肽、转运肽和起始氨基酸切除等也会影响最终蛋白结构，影响连接在肽链两端的其他氨基酸序列，如荧光蛋白和纯化标签等。如果需要获取过表达蛋白产物，还需事先在表达载体上为目的基因增加后期纯化标签（如His标签），以便进一步分离纯化。基因过表达技术目前已经发展较为成熟并被广泛应用于基因功能研究和蛋白生产当中，也将极大促进我们对于基因功能的了解。[1]Prelich G. Gene overexpression: uses, mechanisms, and interpretation[J]. Genetics, 2012, 190(3): 841-854.[2]Fallah A, Estiri H, Parrish E, et al. Biosimilar Gene Therapy: Investigational Assessment of Secukinumab Gene Therapy[J]. Cell Journal (Yakhteh), 2020, 21(4): 433.
|
