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前几期咱们重点介绍了基因表达调控中基因过表达的部分。然而除了过表达我们在研究中也经常会遇到需要降低特定基因表达水平的情况。随后几期推文，小编将为大家继续介绍表达调控中的基因沉默（gene silencing）。 基因沉默，也称基因敲减（gene knockdown）——是基因表达减少至少 70% 的现象。广义上也包含基因编码蛋白功能受损，表现为基因沉默造成功能缺失的情况。 自然条件下生物可在转录、转录后和翻译水平降低基因表达水平。 转录水平的调控主要通过影响基因 DNA 结构的可获得性，阻碍基因序列和转录复合物结合能力，导致基因 mRNA 转录水平降低。 染色质结构开放性、DNA 修饰和基因的位置效应都能显著抑制基因转录水平。 高度压缩的染色质结构必须解旋为足够开放的 DNA 双链结构后才能结合转录因子启动基因转录。因此基因所在染色质结构越致密，相应转录水平就越低。 DNA 核苷酸结构化学修饰，如甲基化、基因印记等，能显著影响基因的转录水平。普通 DNA 核苷酸基团经过化学修饰后，染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性及 DNA 与蛋白质相互作用方式都会相应改变。 启动子、增强子等顺式结构元件和基因间的距离也能影响基因的转录水平，称之为基因的位置效应。一般来说，和启动子、增强子越接近，基因转录水平越高，但并不严格具有线性相关关系。 当前我们对于基因转录水平调控详细机制知之甚少，成熟的调控工具不多。如果只是简单的基因功能缺失研究，并不需要在基因组层面操作，相比之下转录后水平调控更为简便。 1996 年一项研究发现，植物可以借助一种名为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）的机制抵抗病毒 RNA 入侵，并且这种作用和病毒 RNA 序列高度相关。 在此基础上，我们逐渐将共抑制（co-supression）、转录后基因沉默（PTGS）和抑制（quelling）等机制都归类于一种名为RNA干扰（RNA interference，RNAi）转录后基因沉默机制。RNAi 是一种于真核生物中广泛存在，通过 RNA 中和靶基因 mRNA 导致基因沉默的生物机制。核心依赖于微 RNA（microRNA，miRNA）和干扰 RNA（interfering RNA，siRNA）两种小 RNA 分子。这些 RNA 分子能够通过序列互补配对，引导核酸酶复合物结合并降解互补 mRNA 序列。此外，如果结合的是 DNA 修饰相关酶，它们还可以介导互补配对的 DNA 序列修饰（如甲基化），达到基因沉默的效果。真核生物经典的 RNAi 通路包含两步：首先前体 RNA（dsRNA 或 miRNA 前体）转录后会被 II 型核酸酶 Dicer 和 Drosha 剪切为更短小的 siRNA。随后，这些 siRNA 会被装载到沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中，引导复合物对互补 mRNA 序列的降解。siRNA 与靶序列不完全互补配对时，RISC 虽不能降解目标 mRNA，却能够通过结合阻碍 mRNA 的翻译，同样达到基因沉默效果。目前发展比较成熟的基因沉默工具主要包括反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides）、核酶（Ribozymes）、RNAi 和 miRNA。反义寡核苷酸是一种长约 13-25 个碱基单链 DNA 或 RNA 分子，导入宿主后可以通过互补配对，介导核酸酶 H 依赖和非依赖的基因沉默。前者依赖核酸酶 H 对 mRNA 的切割降解、后者则依赖对 mRNA 翻译的阻碍作用。目前基于反义寡核苷酸的药物主要属于核酸酶依赖型，能够有效降低约 80-90% 蛋白和 mRNA 水平。核酶是一种有催化活性的 RNA 分子，天然存在的核酸酶包括 hammerhead、hairpin、hepatitis delta virus、group I、group II 和 RNase P。核酶的催化机制和蛋白核糖核酸酶类似，能结合特定 RNA 序列，攻击临近磷酸盐基团，造成靶 RNA 分子的断裂。这种切割机制经常被用于实现序列特异性的mRNA 降解。质粒或病毒载体体外导入经过特殊设计人工合成的外源双链 RNA（在人组织细胞中导入shRNA）激活宿主 RANi 途径，也能降低特定基因表达水平。外源导入的 dsRNA 能被 Dicer 降解为长度为 20-25 bp 的 siRNA 片段，进一步组装为 RISC 介导靶基因 mRNA 降解或翻译抑制。而外源导入 miRNA 也可以通过类似途径抑制基因表达水平，和 siRNA 不同的是，装载 miRNA 的 RISC 更倾向于和 mRNA 3’ 端序列不完全配对结合，通过阻碍核糖体结合阻碍 mRNA 翻译过程。下表总结了目前常见的造成基因功能缺失的基因沉默手段。其中最直接的是用特定分子结构屏蔽靶蛋白的活性位点，使其失活，表现为基因沉默造成的功能缺失。但这种调控建立在对目标蛋白结构的解析上，很难达到可控稳定的沉默效果，一般用于大分子药物筛选研究中。
基于寡核苷酸的基因沉默手段，如反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ODNs）），虽然历史悠久，导入宿主是也可以不借助载体，却需要在体外完成核苷酸的合成和修饰，成本很高，一般用于核内 lncRNA 沉默研究。基于核酶的基因沉默对宿主要求很高，目前我们对不同宿主对核酶功能的影响还不甚了解，外源导入的核酶功能难以保障。RNAi 技术是目前应用比较广泛的基因沉默手段。首先，基于一些简单有效的原则，我们就可以设计出很多拥有较好靶基因沉默效果的 shRNA。其次，shRNA 不需要额外修饰，直接构建在质粒或病毒载体上就能导入宿主发挥功能，成本相对较低。当然，RNAi 机制主要作用于胞质中的 mRNA，对于核内转录产物没有效果（如lncRNA 等）。随后的推文将继续为大家详细介绍这种常见的基于 RNAi 机制的基因沉默技术，敬请期待。Ecker, J. R. & Davis, R. W. Inhibition of geneexpression in plant cells by expression of antisenseRNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 5372–5376(1986).
Setten R L, Rossi J J, Han S. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2019, 18(6): 421-446.
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