如何分离外泌体？1.超速离心：价格适中、得率和纯度都能兼得2.过滤离心：得率比较低3.密度梯度离心：步骤繁琐，得率较低4.免疫磁珠：特异性比
较高，得率较低5.商用试剂盒：价格高，效果一般如何鉴定外泌体？透射电子显微镜（TEM）：进行形态学观察、纳米颗粒追踪分析（NTA）
：进行粒径和密度分析WB：进行蛋白标志物的鉴定（CD63、CD9、CD81、TSG101、Hsp70、syntenin1）如何研究
外泌体？外泌体的研究方向主要包括以下三个方面：1.寻找疾病诊断和预后的分子标志物。2.揭示疾病发病机制，从微环境角度解释细胞之间通
讯促进疾病发生的原因。3.外泌体作为药物载体，实现靶向给药。针对寻找分子标志物，通常的研究思路如下：针对疾病研究，常见的研究思路如
下（以外泌体miRNA为例）：外泌体核酸标记物外泌体蛋白标记物GPC1?+胰腺癌，乳腺癌，结肠直肠癌，食道癌TRIM3胃癌ZI
P4胰腺癌THBS1口腔鳞状细胞癌αvβ3整联蛋白前列腺癌CRP蛋白胆管癌CD151，CD171，TSPAN
8，EGFＲ，非小细胞肺癌GＲB2，CD91外泌体蛋白标记物1.外泌体TRIM3可作为胃癌诊断和治疗的新标记物（20
18?：ExosomalTRIM3isanovelmarkerandtherapytargetforgastri
ccancer.?JExpClinCancer.）江苏大学的许文荣、钱晖课题组从胃癌患者的血清中分离出外泌体，并鉴定了血清
外泌体的蛋白质组谱。研究发现，与健康对照组相比，胃癌患者血清外泌体中TRIM3蛋白水平降低。TRIM3在胃癌中发挥肿瘤抑制作用，T
RIM3可通过外泌体转运，调节干细胞因子和EMT调节因子，在体外和体内抑制胃癌的生长和转移。结果揭示了外泌体TRIM3可作为胃癌诊
断和治疗的新标记物。2.鉴定血清外泌体中与胆管癌相关的蛋白生物标志物（2017：Serumextracellularvesic
lescontainproteinbiomarkersforprimarysclerosingcholangitis
andcholangiocarcinoma.?Hepatology.）胆管癌（CCA）是恶性度较高的消化系统肿瘤。因其发展隐蔽
且临床症状及体征出现晚，故给早期诊断带来困难。原发性硬化性胆管炎（PSC）是导致胆管癌的主要原因之一。在非侵染时期，鉴定肝内的胆管
癌及肝癌（HCC）是非常困难的。目前尚未有准确区分CCA，PSC，及HCC的生物标记物。为了寻找新的生物标志物，研究者利用高效的外
泌体分离方法，分别从CCA、PSC，和HCC患者的血清样本中分离得到外泌体，运用蛋白质组学技术从中筛选出新的生物标记物，3.外泌体
蛋白ZIP4是胰腺癌的新型诊断生物标志物(2018：ExosomalzinctransporterZIP4promote
scancergrowthandisanoveldiagnosticbiomarkerforpancreati
ccancer.??CancerSci.)研究者运用定量蛋白质组分析中，鉴定出锌转运蛋白ZIP4是高度恶性胰腺细胞系中最上调的
外体蛋白。并且通过皮下BALB/C裸小鼠模型研究表明，外泌体ZIP4可以显著促进胰腺癌的生长。最后研究者在放大的临床血液样本：胰腺
癌患者（n＝24）和良性胰腺疾病患者（n＝32）和胆道疾病患者（n＝32）和健康对照组（n＝46），对蛋白标记物ZIP4进行验证。
4.外泌体GPC1?+是胰腺癌的新型诊断生物标志物（2015.Glypican1identifiescancerexosom
esandfacilitatesearlydetectionofcancer）检测早期胰腺癌的可靠生物标志物，优于CA
19-9的预后标志物，在胰腺癌患者的血清中具有绝对特异性100%和敏感性100%的，可将慢性胰腺炎与早期或晚期胰腺癌区分开来。而
ELISA检测GPC1?+结果特异性为75％，敏感性为82.14％。5.多种抗体鉴定GPC1?+与胰腺癌细胞和胰腺癌患者血清中的外
渗体相关（Multipleantibodiesidentifyglypican-1associatedwithexo
somesfrompancreaticcancercellsandserumfrompatientswithp
ancreaticcancer）通过免疫印迹和蛋白单链分析检测GPC1抗体对胰腺癌细胞及其外源体的特异性。在这里我们报告了三种
抗GPC1?+抗体（ThermoFisher，Sigma，Abnova）在循环中特异性检测GPC1+外泌体的应用(胰腺
癌患者10例与健康者9例和良性胰腺疾病2例)本研究描述了外源体纯化和流式细胞术分析外源体GPC1的方法。6.作为前列腺癌的生物标志
物：分离和表征（2016：Glypican-1asaBiomarkerforProstateCancer:Isola
tionandCharacterization）GPC-1是一种有吸引力的前列腺癌生物标志物，因为它存在于细胞表面并且也被细胞
脱落。由于遗传和蛋白质组突变对癌症患者具有特异性，因此对血液和尿液的外泌体的鉴定为靶向个性化治疗提供了途径。未来的研究正在开发基于
MIL-38的GPC-1ELISA，以评估正常，BPH和前列腺癌患者中GPC-1的水平，以确定分泌的GPC-1是否可代表临床相关
的前列腺癌诊断生物标志物7.循环外泌体中的microRNA特征优于外泌体磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平用于诊断胰腺2017.A?mic
roRNA?signature?in?circulating?exosomes?is?superior?to?exosomal?g
lypican-1?levels?for?diagnosing?pancreatic?cancer比较了正常对照受试者和PDAC和
慢性胰腺炎患者中的外来体磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）和microRNA水平，发现高外泌体水平的microRNA-10b，（m
iR-10b），miR-21，miR-30c和miR-181a以及低miR-let7a容易区分PDAC与正常对照和CP样本。由于不
容易获得高度特异性的抗GPC1抗体，而microRNA显着的稳定性，miR可以作为体循环中的诊断生物标志物8.GPC?1外泌体
及其调节mi?RNA是用于结肠直肠癌（CRC）的检测和靶向治疗的特异性标志物（2017：GPC1exosomeandits
regulatorymiRNAsarespecificmarkersforthedetectionandtar
gettherapyofcolorectalcancer）目前敏感且简单的诊断结肠直肠癌的高效靶向治疗的生物标志物仍然在
临床上不可用。研究测量了肿瘤组织和血浆中GPC1?+?exosomses?量的含量，高水平的血浆GPC1?+外泌体是CRC患者的特
征，手术治疗可降低其百分比。CRC肿瘤组织和CRC患者血浆的外泌体含有明显多于正常结肠组织和健康对照血浆的GPC1蛋白，并且治疗可
下调CRC肿瘤外泌体中GPC1蛋白的表达。9.一种可靠的测定血浆和血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的方法，揭示了循环glypican
-1作为一种新的前列腺癌生物标志物（2018：Developmentofareliableassaytomeasur
eglypican-1inplasmaandserumrevealscirculatingglypican-1a
sanovelprostatecancerbiomarker.）报告了可靠的定制Luminex?assay测定可以精
确定量血浆和血清中的循环人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（基于磁珠的测定法，其使用MIL-38作为捕获抗体和由我们开发的新的单克隆抗体3G
5作为检测抗体）。使用该测定法，我们首次显示循环glypican-1水平可以区分前列腺癌患者的非癌症（正常和良性前列腺增生）患者，
以及单独来自前列腺癌患者的良性前列腺增生患者。10.外泌体miRNA在肺癌早期诊断中的应用（2017.Evaluation?of
?Tumor-Derived?Exosomal?miRNA?as?Potential?Diagnostic?Biomarkers?
for?Early-Stage?Non-SmallCellLungCancer?Using?Next-Generation
Sequencing.）运用高通量测序技术对46个I期非小细胞肺癌患者和42个健康人员的外泌体miRNA进行分析，以鉴定和验证腺癌
和鳞状细胞癌特异性miRNA。检测发现腺癌特异性miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-
5p，以及鳞状细胞癌特异性miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b，并且对比后发现这些miRNA可能是有效的早
期非小细胞肺癌非侵入性诊断的生物标志物。11.循环外泌体的微小RNA作为用于筛选和诊断肺癌的非侵入性生物标志物（2013.micr
oRNAs?derived?from?circulating?exosomes?as?noninvasive?biomarkers
?for?screening?and?diagnosing?lung?cancer.）对10例肺腺癌患者、10例肺肉芽肿及10例健
康吸烟者的共30例血浆样本进行qRT-PCR检测并初步筛选，随后针对包含50个肺腺癌、30个肺肉芽肿和25名健康吸烟者的大样本进行
检测再次筛选后，发现miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p的表达水平有助于鉴别结节群（肺腺
癌和肺肉芽肿）与非结节群（健康吸烟者），进一步检测miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-6
29、miR-100和miR-154-3p表达水平有助于鉴别结节群中的肺腺癌患者与肺肉芽肿患者。且前者具有97.5%敏感性与72.
0%?特异性，后者具有96.0%?敏感性及60.0%特异性。http://www.exosomedx.com/patients/l
ung-cancerExoDxhttp://www.exosomedx.com/patients/lung-cancer?http
://www.exosomedx.com/patients/lung-cancerLung(ALKhttp://www.exoso
medx.com/patients/lung-cancer)试剂盒基于外泌体RNA，检测肺癌EML4-ALK融合基因突变，可检测5
种突变，敏感度88%，特异度100%。该试剂盒可同时检测外泌体中RNA和ctDNA，灵敏度提高了3倍以上，检测手段是抽提RNA，测
序分析突变。而此前，对于EML4-ALK的检测是基于组织活检的荧光原位杂交技术或免疫组化，而且FISH缺乏灵敏性，误诊率也高。
http://www.exosomedx.com/patients/lung-cancerExoDxhttp://www.exos
omedx.com/patients/lung-cancer?http://www.exosomedx.com/patients/
lung-cancerLung(EGFRhttp://www.exosomedx.com/patients/lung-cancer
)/T790Mhttp://www.exosomedx.com/patients/lung-cancer试剂盒该试剂盒检测外泌体中
RNA和ctDNA敏感度92%，特异度89。而FDA批准的cfDNA检测EGFR突变的试剂盒敏感度58%，特异度80%.联合外泌体RNA和ctDNA液体活检，提高对EGFR突变的检测I（2018：ImprovedEGFRmutationdetectionusingcombinedexosomalRNAandcirculatingtumorDNAinNSCLCpatientplasma）分离外泌体和ctDNA并提取核酸并使用靶向NGS测定（EXO1000）筛选EGFR突变，研究结果发现，exoRNA和ctDNA的联合检测增加了血浆中EGFR突变检测的敏感性，检测EGFR激活突变的灵敏度为98％，EGFRT790M为90％。BEAM对ctDNA的敏感性分别为82％，T790M为84％。Thanks！ |
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