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尽管MALDI原则上是一种软电离技术，几乎只产生完整的生物分子离子，但MALDI在电离过程中会形成相当程度的亚稳态离子。对于肽和蛋白质离子，这种亚稳定的离子行为不仅会引起中性小分子（如水和氨）的损失，还会引起多种肽键断裂。MALDI-MS中有两种不同类型的碎片反应：（i）在激光撞击后几百ns内，质谱仪的离子源附件的离子的“迅速碎片” （prompt fragmentation）和（ii）PSD则需要较长一些的时间（μs），在将来源于MALDI的离子从离子源提取到RETOF质谱仪的第一个无电场区域的过程。一般认为，分析物离子在萃取过程中的碰撞激活，以及在电离过程后能量过剩的离子的单分子衰变，都被认为是造成PSD现象的原因。 由于PSD发生在无电场区域，碎片离子的速度与其完整的母离子保持相同的速度，因此在线性MALDI-MS光谱中不能被观察到。可以通过用一个静电离子镜或“场电子场”代替无场区末端的检测器，这会颠倒入射离子的飞行路径，碎片离子就可以从其完整的母离子中分离出来。由于它们的动能较小，它们不像完整离子那样深入反射层，因此会更早地从该场中弹出，并且在MALDI-RETOF-MS光谱中的表观质量会低于其前体离子。由于大多数反射电子场在给定的电压设置下仅具有有限的动态分离范围，因此需要将其逐步降低到较低的电压，以便分离和聚焦整个目标碎片质量范围（通常可以获得10-15个片段）。一旦反射电子场通过人工合成的已知肽段进行了校准，即可将片段光谱胶合在一起以形成PSD光谱，这时所有片段离子的质量都可以确定。也可以使用弯曲场反射器，将场几何（field geometry）同时应有于分离和聚焦产生的所有碎片离子，从而避免使用单级或双级反射器的耗时的电压渐进过程。 通过研究肽离子的MALDI-PSD片段，可以推测PSD是酰胺键断裂的主要结果，非常类似于低能碰撞活化解离（CAD）诱导的肽的片段化行为。如，N末端碎片离子（a，b，c和d型碎片），C末端碎片离子（x，y和z型碎片）以及由同一前体离子的多次碎片化而产生的内部碎片均能在MALDI-PSD光谱中观察到。此外，由于小片段中性分子（如丝氨酸和苏氨酸残基中的水以及赖氨酸和精氨酸中的氨）的损失，PSD碎片离子会出现卫星峰。且PSD碎片主要发生在肽键上，因此在MALDI-PSD光谱中主要观察到b型和y型碎片离子。由于PSD光谱的高度复杂性（主要是由各种强烈的内部片段化，缺乏完整的肽主链片段化以及高质量片段的质量准确性低引起的），所以很少将MALDI-PSD用于蛋白质谱鉴定。此外，当在MALDI质谱仪的离子源中使用延迟萃取时，前驱体离子被冷却，这与使用连续离子萃取的质谱仪中的PSD相比，碎片效率降低。PSD的降低效应可能非常高（一个数量级），但会通过碎片离子的分辨率和准确性（碎片同位素分辨率超过1000 Da）进行补偿。尽管有这些缺点，但最近几年也有许多研究表明，隐藏在PSD光谱中的序列信息可以帮助甚至指导蛋白质谱鉴定。 尽管MALDI-PSD光谱图比较复杂，但在许多情况下仍可获得序列信息，如肽序列中一个或几个连续氨基酸的准确位置。而且，已经证明使用带有质量标记的末端会使光谱解释起来更容易。一个成功的例子是在蛋白质消化过程中用18O同位素部分标记C末端的羧基部分。在MALDI-PSD光谱中，包含C末端18O同位素标记（主要是y和z型离子）的片段可以很容易地与包含N端的片段区分开（例如，参见图1）。通过减去标记片段离子的质量，可以获得氨基酸残基质量，从而实现短氨基酸片段的从头测序。一旦获得了序列信息，就可以通过算法使用蛋白质和DNA数据库来识别目标蛋白质。数据库如： ProteinProspector的Ms-Tag和Ms-Seq：http://prospector./prospector/mshome.htm； PepFrag算法：http://prowl./； PeptideSearch：http://peptsearch./FR_PeptidePatternForm.html。  图1. MALDI-PSD分析示例。通过MALDI-PSD光谱法，对SDS-PAGE获得的来自人源14-3-3蛋白进行胰蛋白酶消化后得到的肽段NH2-EMQPTHPIR-COOH，进行蛋白质质谱鉴定。在胰蛋白酶消化过程中掺入18O同位素，可以部分标记C末端，从而可以在PSD光谱中分离所有包含该标记的肽片段。图中显示了衍生的肽通过y离子标签（385.49到522.54 m/z）搜库，该标签用于在只包含人源蛋白的非冗余蛋白数据库中识别该蛋白。 有研究表明，PSD片段化可以受多肽化学修饰的影响，如果通过序列标签的方式可以更容易的验证。一种方法是通过使用氯磺酰乙酰氯引入一个负电荷的方式，对肽N末端的氨基进行修饰。在MALDI-PSD光谱中，含有负电荷N端的片段被大大抑制，主要出现的是y离子，以及较y型离子少的z型离子。此外，大大提高了修饰肽的整体片段化效率，使MALDI-PSD对肽序列进行从头测序成为可能。但是，该方法仍然仅限于缺少赖氨酸残基的肽。 Yates等最初将串联质谱MS用于质谱蛋白质鉴定的研究人员，对SEQUEST算法进行升级，将不能破译的MALDI-PSD谱图与数据库中可用的已知肽段氨基酸序列关联起来。通过这一改进，大大降低了手动分析PSD获取的光谱图的时间。MassFrag的算法，能够指出肽的理论片段谱与一小部分候选肽中的实验PSD谱的最匹配信息。使用这种方法，我们能够明确地识别肽质量指纹图谱的蛋白质，哪些由于精确测量的肽质量的数量少或因为样品的复杂性的蛋白质也能被识别。一种使用片段化规则从PSD光谱生成大量从头氨基酸序列的算法，提出将氨基酸序列用于扫描数据库中存在的相同或同源序列，从而实现所对分析蛋白质的鉴定。 科学家们，成功地使用了从MALDI-PSD光谱中存在的片段化信息来进行蛋白质谱鉴定。为了充分利用这种蛋白质鉴定技术在蛋白质组学领域的潜力，科学家们尝试创建可以在庞大的序列数据库中进行更快，更特异性的蛋白质鉴定的算法。通过简单地重新索引并以一种简化且易于访问的格式存储实际序列数据，可以在几秒钟内获得大量的非冗余蛋白质数据库。 本文由百泰派克生物科技整理编辑。 北京百泰派克公司采用高分辨率质谱平台技术，包括Thermo Fisher的Q Exactive质谱仪，LTQ Orbitrap Velos质谱仪，以及AB SCIEX的6500 Q TRAP质谱仪，结合 Nano-LC高通量液相色谱技术，能够对SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋白胶点等样品中的蛋白质进行高效精准鉴定。胶条、胶点蛋白质谱鉴定服务可保证100%的鉴定率，否则不收任何费用。 文献参考：Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis, 2000. |
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