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vcf文件是储存样本变异信息的文件，如果不采用joint calling的方式进行分析，最终会获得单个样本的变异数据。为了便于对同组不同样本进行差异SNP分析，就需要对文件进行合并。vcf文件的合并有很多的软件可以做，GATK、vcftools和bcftools三款软件最常用，但是具体的合并方法需要根据vcf文件中的信息来判断。 1. 样本相同、位点独立的vcf文件合并样本相同、位点独立指的是在不同文件中包含的样本一致，但是彼此之间位点没有交集，分染色体call变异就是这种类型，可以使用以下的三个方法。1.1 gatk：GatherVcfs|MergeVcfsgatk4提供了两种vcf文件合并的方法，分别是GatherVcfs和MergeVcfs，两个方法都是对相同样本数据集的变异结果进行合并，命令示例如下。# GatherVcfs
gatk GatherVcfs -I concat-a.vcf -I concat-b.vcf -O combine_a_b_samesample_diffsites.vcf
# MergeVcfs
gatk MergeVcfs -I concat-a.vcf -I concat-b.vcf -O combine_a_b_diffsample_allsites_gatk.vcf
##fileformat=VCFv4.2
##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth">
##contig=<ID=1,length=17540695>
##contig=<ID=2,length=14896646>
##contig=<ID=3,length=12399606>
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT A
# concat-a.vcf文件位点
1 100 . GTTT G 1806 q10 DP=35 GT:GQ:DP 0/1:409:35
1 110 . C T,G 1792 PASS DP=32 GT:GQ:DP 0/1:245:32
1 120 . GA G 628 q10 DP=21 GT:GQ:DP 1/1:21:21
1 130 . GAA GG 1016 PASS DP=22 GT:GQ:DP 0/1:212:22
1 140 . GT G 727 PASS DP=30 GT:GQ:DP 0/1:150:30
1 150 . TAAAA TA,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 1/2:12:10
2 100 . GTTT G 1806 q10 DP=35 GT:GQ:DP 0/1:409:352 110 . CAAA C 1792 PASS DP=32 GT:GQ:DP 0/1:245:32
2 120 . GA G 628 q10 DP=21 GT:GQ:DP 1/1:21:21
2 130 . GAA G 1016 PASS DP=22 GT:GQ:DP 0/1:212:22
2 140 . GT G 727 PASS DP=30 GT:GQ:DP 0/1:150:30
2 150 . TAAAA TA,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 1/2:12:10
2 160 . TAAAA TA,TC,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 0/2:12:10
# concat-b.vcf文件位点
3 241 . GTTT G 1806 q10 DP=35 GT:GQ:DP 0/1:409:35
3 251 . CAAA C 1792 PASS DP=32 GT:GQ:DP 0/1:245:32
3 261 . GA G 628 q10 DP=21 GT:GQ:DP 1/1:21:21
3 271 . GAA G 1016 PASS DP=22 GT:GQ:DP 0/1:212:22
1.2 vcftools：vcf-concatvcf-concat并不是vcftools的一个子命令，而是软件安装目录下附带的功能模块，vcftools安装完成后可以直接使用，命令如下。/vcftools/bin/vcf-concat concat-a.vcf concat-b.vcf > combine_a_b_samesample_diffsites_vcftools.vcf
在进行较大文件合并时，最好将vcf文件进行压缩并创建索引，效率会快。如果待合并的vcf文件很多，可以将文件名写入到一个文件，由参数-f指定并进行后续操作。该命令合并完的vcf与gatk结果一致，只不过表头信息顺序会发生改变，不影响数据使用。1.3 bcftools：concatbcftools软件在处理vcf文件时，某些情况下会优于vcftools，合并vcf文件的命令如下。bcftools concat concat-a.vcf concat-b.vcf -o combine_a_b_samesample_diffsites_bcftools.vcf
合并之后的vcf文件位点信息与其余两款软件处理结果一致，只不过在输出结果的header中会出现运行的命令，示例如下。##bcftools_concatVersion=1.3.1+htslib-1.3.1
##bcftools_concatCommand=concat -o combine_a_b_samesample_diffsites_bcftools.vcf concat-a.vcf concat-b.vcf
2. 样本不同，位点相同或不同这种合并方式主要是对不同样本的变异文件进行合并，合并时共有位点会进行合并统计，非共有位点若在某一个样本中没有变异，则会自动记为缺失。2.1 vcftools:vcf-merge模块名称为vcf-merge，在进行merge操作时，会对文件中的位点进行重排，耗时较长。输入文件需要压缩后创建索引，示例命令如下。bgzip merge-test-a.vcf.gz && tabix merge-test-a.vcf.gz
bgzip merge-test-b.vcf.gz && tabix merge-test-b.vcf.gz
/vcftools/bin/vcf-merge merge-test-a.vcf.gz merge-test-b.vcf.gz > combine_a_b_diffsamples_allsites_vcftools.vcf
合并之后会对不同文件中的数据集进行整合，没有变异的位点会自动标记为缺失。2.2 bcftools:mergebcftools merge merge-test-a.vcf.gz merge-test-b.vcf.gz -o combine_a_b_diffsamples_allsites_bcftools.vcf
该方法也需要预先对所有vcf文件进行压缩并创建索引，否则程序无法运行。 2.3 gatk:CombineVariantsgatk3提供了一个CombineVariants可以进行变异数据的合并，而gatk4中貌似并没有相同功能的模块。CombineVariants使用如下。java -jar /GenomeAnalysisTK-3.8/GenomeAnalysisTK.jar -T CombineVariants -V merge-test-a.vcf -V merge-test-b.vcf -o combine_a_b_diffsample_allsites_gatk.vcf -R ref.fna
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT A B
1 3062915 . GTTT G,GT 1806 q10;q20 AC=1,1;AF=0.250,0.250;AN=4;DP=49;set=FilteredInAll GT:DP:GQ 0/1:35:99 0/2:14:99
1 3106154 . CAAAA CA,C 1792 PASS AC=1,1;AF=0.250,0.250;AN=4;DP=47;set=Intersection GT:DP:GQ 0/1:32:99 0/2:15:99
1 3157410 . GA G 628 PASS AC=3;AF=0.750;AN=4;DP=32;set=filterInvariant-variant2 GT:DP:GQ 1/1:21:21 0/1:11:49
1 3162006 . GAA G 1016 PASS AC=2;AF=0.500;AN=4;DP=41;set=Intersection GT:DP:GQ 0/1:22:99 0/1:19:99
1 3177144 . GT G 727 PASS AC=2;AF=0.500;AN=4;DP=54;set=Intersection GT:DP:GQ 0/1:30:99 0/1:24:99
1 3184885 . TAAAA TA,T 246 PASS AC=2,1;AF=0.500,0.250;AN=4;DP=26;set=Intersection GT:DP:GQ 1/2:10:12 0/1:16:99
2 3188209 . GA G 162 . AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=15;set=variant2 GT:DP:GQ ./. 0/1:15:99
2 3199812 . G GTT,GT 481 PASS AC=1,1;AF=0.500,0.500;AN=2;DP=26;set=variant GT:DP:GQ 1/2:26:99 ./.
3 3199812 . G GTT,GT 353 PASS AC=1,1;AF=0.500,0.500;AN=2;DP=19;set=variant2 GT:DP:GQ ./. 1/2:19:99
3 3199815 . G A 353 PASS AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=19;set=variant2 GT:DP:GQ ./. 0/1:19:99
3 3212016 . CTT C,CT 565 PASS AC=1,1;AF=0.500,0.500;AN=2;DP=26;set=variant GT:DP:GQ 1/2:26:91 ./.
4 3212016 . CTT C 677 q20 AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=15;set=FilteredInAll GT:DP:GQ ./. 0/1:15:99
4 3258448 . TACACACAC T 325 PASS AC=1;AF=0.500;AN=2;DP=31;set=variant GT:DP:GQ 0/1:31:99 ./.
需要注意的就是，merge合并之后，不同软件生成的结果在数据统计上会存在很大的差异，示例如下。# merge-test-a.vcf
1 3184885 . TAAAA TA,T 246 PASS DP=10 GT:GQ:DP 1/2:12:10
# merge-test-b.vcf
1 3184885 . TAAA T 598 PASS DP=16 GT:GQ:DP 0/1:435:16
# combine_a_b_diffsamples_allsites_vcftools.vcf
1 3184885 . TAAAA TA,T 422.00 PASS AC=2,1;AN=4;DP=26;SF=0,1 GT:DP:GQ 1/2:10:12 0/1:16:435
# combine_a_b_diffsamples_allsites_bcftools.vcf
1 3184885 . TAAAA TA,T 598 PASS DP=26 GT:GQ:DP 1/2:12:10 0/1:435:16
从上面的实例可以看出，在合并过程中需要重新输出分型质量，vcftools会对统计结果进行平均取值，bcftools取其中的最大值输出，而gatk会取最小值输出，并且gatk和vcftools在原有统计数据基础之上，还会重新计算AC、AN等指标。
对于vcf数据合并，由于不同样本发生的变异很难保证一致，所以在合并不同样本的数据时，结果往往具有很高的缺失率，后续的差异分析实质上只是对不同样本的共有位点进行分析，丢失了某些样本或群体的特有变异位点。为了避免这种情况，多样本差异分析的项目最好是用joint calling进行变异检测，能获得更多的位点。3. 猜你喜欢4. 参考文件[1] https://gatk./hc/en-us/articles/360046221931-GatherVcfs-Picard-
[2] http://samtools./bcftools/bcftools.html#concat
[3] https://gatk./hc/en-us/articles/360045800732-MergeVcfs-Picard-
[4] https://vcftools./man_latest.html#如有错误，欢迎指正#
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