摘要：双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原 ，其结构多样性 的快速 发展产生了大量新颖的双特异性抗体支架， 并提供了巨大的功能多样性。 目前医药研发中最常用的两种形式的双特异性抗体是基于单链可变片段（ scFv ）的抗体（无Fc片段）和全长IgG样不对称抗体。与传统的单克隆抗体不同，双特异性抗体 的数量，质量 和稳定性 等都阻碍了其更广泛的临床应用。 本文基于这两种主要的双特异性抗体类型，描述了其在设计，生产和质量方面的最新研究进展和性能提升的策略。
1.抗体概述
1.1抗体的肿瘤治疗
机理：通过靶向在肿瘤细胞上过度表达或独特表达的表面抗原，单克隆抗体已成功用作癌症治疗剂。基于抗体的癌症免疫疗法的功效主要涉及 以下两个因素：（ 1 ）阻断或结合因子激活的细胞死亡 ，或通过抑制癌症细胞信号通路的激活以导致肿瘤细胞死亡 。例如，曲妥珠单抗靶向乳腺癌和胃癌细胞中的 HER2 受体，以抑制其增殖和存活 ，西妥昔单抗抑制结肠直肠癌和肺癌 中的表皮生长因子受体（ EGFR ）;（2）通过免疫细胞上的Fc受体（FcR）与抗体的Fc片段结合 产生的免疫效应子功能 诱导肿瘤靶细胞死亡，如F ig .1b 所示的抗体依赖性细胞毒性（ ADCC ），补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP） 。
缺陷：传统抗体治疗的一个主要缺点是肿瘤的 渗透率和保留率低。许多针对肿瘤特异性抗原的治疗性 mAb 大多保留在 血液循环中，通常只有 20 %的给药剂量与实体瘤的表面蛋白相互作用 。此外，大多数 mAb 起到阻止生长因子与其受体结合的作用，但是 通常由于患者的免疫应答不足（尤其是重新激活 T 细胞以破坏肿瘤）而无法诱导肿瘤的凋亡。
1.2基本结构
双特异性抗体：双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原，例如同时结合肿瘤细胞受体和募集细胞毒性免疫细胞。这种增强的功能 可以降低副作用 并减小注射 量。通过数十年来对双特异性抗体及其衍生物的探索和开发，市场上有两种常见的双特异性抗体形式： 基于单链可变片段（scFv ）的抗体（无Fc片段）和基于全长IgG 的抗体。与传统的单克隆抗体不同，双特异性抗体在数量，质量和稳定性方面的巨大生产挑战已经阻碍了其更广泛的临床应用 。下面将 基于这两种双特异性抗体形式 介绍双特异性 抗体的设计和制造，并描述通过采用一系列操作策略实现的 其生产能力和质量的发展。
2.提高双特异性抗体生产和质量的策略
2.1单链可变片段（scFv ）抗体
单链可变片段（scFvs ）是功能性抗体 最简单的形式，它是通过柔性多肽linker将 IgG 重链（VH）和轻链（VL）的可变域融合而产生的。ScFv的分子量在25 kDa左右，具有单个抗原结合位点。 开发scFv 抗体的几个重要考虑因素是抗体片段类型，linker类型和生产能力。
2.1.1抗体片段类型
如F ig.2a 所示，目前主要有三种 基于scFv 的双特异性抗体片段：双特异性 T 细胞接合器（BiTE ），双亲和性 重靶向蛋白（ DART ）和串联双抗体（TandAbs） 。
BiTE：BiTE 使用来自两个不同单克隆抗体的scFv片段，通过肽linker连接使它们在组装时能够保留每种抗体的结合活性。连接两个scFv 的短柔性linker使 得两个臂 可以自由旋转，这对于与两个相对的细胞膜（ 即细胞毒性 T 细胞和肿瘤细胞）上的靶向受体灵活相互作用以及随后诱导 激活T 细胞至关重要。 目前最成功的 BiTE 药物是blinatumomab，已 获FDA 批准 治疗急性淋巴细胞白血病（ ALL ）。Blinatumomab由VL-VH方向的抗CD19 scFv通过短甘氨酸/丝氨酸（GGGGS）linker连接至VH-VL 方向的抗CD3 scFv组成 ，作用机制如F ig. 2b 所示。
DART：DART 由两个Fv片段 组成， 形成二聚体后获得两个独特的抗原结合位点。具体来说， Fv1 由抗体A的VH和抗体B的VL组成，而Fv2由抗体B的VH和抗体A的VL组成。在每个重链的末端添加另一个半胱氨酸残基可通过形成C端二硫键来提高稳定性。与 上述通过多肽linker连接的 BiTE 抗体不同，这种组合使DART可以模仿IgG分子内的自然相互作用 ，在体外和体内 给药都可以保持效力 ，并且生产种聚集的规模 更低。 研究人员比较CD19xCD3 DART 和BiTE分子体外杀死B细胞淋巴瘤的能力发现，DART分子始终优于BiTE分子。
TandAbs：小尺寸 scFv 与天然抗体相比 更有助于提高肾脏清除率 ，一个解决尺寸问题的方案 就是 TandAbs 。这 种四价双特异性抗体 向每个抗原提供了两个结合位点以保持自然二价抗体 的活性。此外， TandAbs 的分子量（约105 kDa的）超过肾清除阈值， 与更小的抗体 相比能够提供更长的半衰期。 目前两种 TandAb 格式的药物正在临床试验中 ，即用于 NK 细胞募集的AFM13（CD30xCD16）和用于T细胞募集的AFM11（CD19xCD3）。
2.1.2Linker
轻链和重链结构域之间的linker区域在稳定抗体中起着重要作用，因此是优化scFvs 的重要目标。ScFv可以以VH- linker-VL 或VL-linker-VH 形式的单个多肽链组装，其中linker桥接相应域C 和N末端之间的间隙。linker设计中的两个基本考虑因素是氨基酸组成和序列长度。
氨基酸组成：氨基酸组成对于设计可行且灵活的linker至关重要 。当前最常用的氨基酸序列基序是( G4S)n （G4S是 指四个甘氨酸残基和一个丝氨酸残基）。优 先选 择甘氨酸和丝氨酸是因为它们的短侧链 使得构象柔性 更好且免疫原性 更小， 并且丝氨酸 能够改 善溶解度。除了传统的 Gly-Ser 样linker外，其他设计还包括带电荷的残基，例如谷氨酸和赖氨酸以增强溶解性，而高通量选择方法（如噬菌体展示）也有助于针对某些特定抗体条件优化而设计和生成linker。
序列长度：Fv 结构域的重链和轻链之间的linker长度对于组装正确的scFv 构象也至关重要。 合适的linker应 该能够在一个 V 结构域的C末端和另一个V结构域的N末端之间跨3.5 nm（35Å）， 从而不会影响 Fv 的天然构象。Linker的长度 对多聚体形成的抗体 具有显著影响，研究显示，linker长度超过 12 个氨基酸残基 可使重链和轻链结构域之间 保持足够的距离 以缔合形成单体；而连接VH 和VL的较短linker可以阻止两个结构域的直接缔合，导致不同 scFv 分子的重链和轻链之间配对的可能性增加，形成二聚体，三聚体或更高阶的寡聚体 。因此通过适当地设计linker长度，可以有效地促进被设计为双 特异性抗体的 scFv 分子的形成（特别是TandAbs） 。
设计思路：最佳双特异性 scFv 的linker设计需要仔细考虑上述原理。 研究者最初 的尝试集中在设计直接连接两个单价单链抗体的linker上 ，这些链间linker的氨基酸组成等因素可能会对单链双特异性抗体的功能产生影响 。目前linker的设计更加注重linker的长度并实现所需的抗体构象和结构域关联 。如Fig. 2a 所示 ，对于BiTE ，在同源域的重链和轻链之间放置长linker以确保缔合，而异源重链片段之间的短linker（ GGGGS linker）则形成两个Fv 之间的连接 ；对于DART ，由于是相互结合形成功能性二聚体的双链， 所以其中 VHA /VLB 或VHB/VLA 之间的linker需要短至5 个氨基酸，以防止不良的非同源配对。 而且二硫键的定位是 DART 分子的另一个关键特征，它可以使分子保持正确的方向 ；对于TandAb ，其linker 的设计与 DART 中的短linker相似 。
2.1.3scFv 抗体的稳定性
scFv 分子的稳定性是一个重要的因素， 其稳定性 是生物活性 及作为功能性双特异性抗体的基础。 在第2.1.4 节的双特异性 scFv 表达和生产中，讨论了通过改变表达环境和引入辅助分子（例如分子伴侣）来改善scFv溶解度和稳定性的许多不同方法。本节重点介绍通过直接修饰scFv框架来实现最佳蛋白质稳定性的方法 ，即环接枝 方法和诱变 方法。
环接枝方法：环接枝方法可能有利于产生治疗性scFv ，因为该过程可通过将抗原特异性互补决定区（CDR） 接枝到具有合适生物物理特性（包括稳定性）的框架上，从而一步实现稳定化和人源化 。例如， 研究者通过将来自 15 种不同兔单克隆抗体的CDRs移植到人scFv支架上 ，成功构建了稳定的人源化兔可变域 。
诱变方法：诱变方法即通过合理的位点特异性突变优化结构或通过蛋白定向进化来实现稳定性的增强（即诱导随机诱变，然后进行阳性选择）。例如，最常见的基于突变的优化方法之一是共有序列方法，在这种方法中，考虑到分子进化和选择，同源 Fv 域中任何位置 出现最频繁 的氨基酸被认为有助于 其稳定性 ，而这些共有序列 的突变预期对稳定性有积极的影响 。此外，创建域间二硫键，分子内氢键和 优化疏水性 也是一些基于突变的可行性方法。
2.1.4双特异性sc Fv 抗体的表达和生产
适当的宿主平台是scFv 抗体有效表达和生产 的决定因素， 目前常用的可行 性scFv 表达平台包括细菌，酵母，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物和无细胞系统。双特异性scFv蛋白的最佳表达系统尚待确定，因为重组蛋白的大小，氨基酸序列和构象差异 等因素使得很难得出一个优化蛋白产量和质量的通用表达系统。 T able1列出 了研究中成功表达 过双特异性 scFv 及其融合分子 的细菌和哺乳动物 表达系统。
大肠杆菌表达系统：大肠杆菌是 scFv 表达 中最广泛使用的宿主之一。 主要因为其生长迅速，成本 低，高异源蛋白质生产 效率，易于理解的遗传学以及 相对容易 的基因操作。与糖基化的完整抗体蛋白不同， scFv 分子在细菌中更容易产生。然而利用这种高产量表达系统仍然存在挑战，其中之一是 错误折叠和包涵体导致的蛋白质溶解度不足。 这种生产可溶性scFv 的效率低下是由于缺乏分子伴侣和翻译后机制，以及大肠杆菌细胞质的还原环境阻止了二硫键的形成。因此 从大肠杆菌 系统中成功表达 的功能性 scFv 分子通常需要其他程序或 修饰。 例如，随后的蛋白质复性和回收步骤可以整合到该过程中，包括用尿素和盐酸胍等进行增溶处理，以及用透析等方法通过除去增溶剂促进可溶性蛋白的复性。
哺乳动物细胞代表系统：哺乳动物细胞由于其先进的蛋白质折叠途径和翻译后修饰，代表了最广泛使用的治疗性蛋白质生产平台和双特异性 scFv 的有前途的表达载体。哺乳动物细胞可稳定表达并生产可溶性重组蛋白。例如， 研究者曾通过中国仓鼠卵巢（ CHO ）细胞表达具有生物活性的scFv分子，而在细菌中表达的相同蛋白质则显示出较少的活性，甚至具有明显不同的二级结构 。
其他表达系统：除细菌和哺乳动物细胞外，其他表达系统在涉及 scFvs 表达的各种研究中也显示出优势，并且可能在将来成为双特异性scFvs大规模生产平台的潜在候选者。酵母作为真核微生物不仅能够产生正确折叠且功能齐全的蛋白质，而且还可以在简单的培养基中存活并快速生长 ；昆虫细胞可以利用杆状病毒介导的基因表达系统在病毒感染的昆虫细胞中通过多面体基因启动子实现高基因表达水平 ；利用植物 细胞生产重组蛋白被认为是大规模生产蛋白质的理想方法 ，培育瞬时表达或稳定的转基因植物，随后从叶组织蛋白提取 scFv 分子 。
2.2全尺寸IgG 样不对称双特异性抗体
虽然IgG 样不对称双特异性抗体与天然单克隆抗体具有某些相似的特性，但 这种工程化分子 并不是 由典型的B 细胞产生 ，不对称IgG 样双特异性抗体生产的最大挑战之一是确保抗体片段的正确组装，这是大规模生产双特异性抗体的前提。随机装配四个独特的多肽链（两个不同的重链和两个不同的轻链）会产生16 种组合（10种不同的分子构型），其中只有两个 为所需的不对称异二聚双特异性抗体 ，其余的配对 会导致非功能性或单特异性分子。因此通过优化双特异性抗体的正确组装，可以大大提高从大肠杆菌和哺乳动物细胞中产生的双特异性抗体的质量 和数量。
Table 2 中总结了几种IgG样双特异性抗体分子的生产实例 ，产生所需 IgG 样双特异性抗体必须主要解决两个问题：两个不同重链的异二聚化以及两个轻链 / 重链相互作用的区别。 研究者已经 开发出了可行的遗传和细胞工程策略以优化 Y 型IgG样双特异性抗体 的生产，例如 四源杂交瘤技术， knobs-into-holes 技术，常见的重链和轻链策略， CrossMab 和共培养方法 等。以下各节 主要描述这些重要策略。
2.2.1四源杂交瘤（或二次杂交瘤）技术
杂交瘤细胞生产双特异性抗体时，理论上两条不同的重链和两条不同的轻链的随机装配可以产生 10 种不同的分子构型，其中只有1种是功能性双特异性抗体 （其余为6 种单特异性抗体 ，3 种无活性抗体 ），因此从这些副产物中分离目标双特异性抗体 十分费力。
如Fig.3a 所示，通过融合小鼠和大鼠杂交瘤细胞系开发了一种嵌合四 源杂交瘤技术。每个杂交瘤细胞表达具有预定特异性的独特单克隆抗体 ，然后将两个表达抗体的细胞融合，得到的杂交 - 杂交瘤细胞表达来自两个亲本的免疫球蛋白重链和轻链，组装 后可以形成亲本和杂交免疫球蛋白。 这种方法由于优先物种限制的重 / 轻链配对 ，嵌合小鼠 / 大鼠bsAb的含量 显著富集， 从而明显优于常规 的小鼠 / 小鼠或大鼠/大鼠中的随机配对。此外，大鼠重链不结合蛋白A，bsAbs中的小鼠重链可以在pH 5.8上洗脱，而全尺寸亲本小鼠Ab可以在pH 3.5上洗脱 ，因此 该差异为通过蛋白 A 和离子交换色谱分离 目标双特异性 抗体提供了简便的纯化过程。 2009 年在欧洲首个被批准用于治疗恶性腹水的IgG样双特异性抗体Catumaxomab（抗EpCAM x抗CD3） 即通过四 源杂交瘤技术 制备而成。
2.2.2重链装配：Fc 异二聚化
Fc 异二聚体化可 以通过消除正常单克隆抗体的形成来减少不同形式可能组合的数量， 从而提高双特异性分子生成的概率。异二聚体重链是通过将两条互补但不完全相同的重链结合而形成的 ，然后每条重链可以与不同的轻链结合，从而产生四种可能性：1种双特异性分子，1种非功能性组合和2种单特异性分子。这种方法 使得可能的抗体组合从 10 种大大减少到 其中的4 种。如Fig. 3b 所示，Fc 的异二聚化是通过Fc 的CH3结构域（恒定区的最后一个结构域）相互连接实现的，可以应用 如下不同的技术来工程化 CH3 域，以将两个不同的Fc域正确地相互连接 。
Knobs-into-holes 技术：该技术在每个重链 的CH3 域中产生“ knob”或“ hole”以促进 Fc 异二聚化 。具体的，CH3 结构域中的一个小氨基酸被一个较大的氨基酸（T366Y）取代，形成一个knob变体，另一个CH3 结构域中的一个大氨基酸被一个较小的氨基酸（Y407T）取代，产生一个hole 变体， 从而使得两个工程化结构域可以彼此适合 并达成异二聚化。 Knobs-into-holes 技术不仅通过双特异性抗体的正确异源二聚体配对解决 了重链 的问题，而且 获得了更为稳定 的构象，并允许通过蛋白 A 纯化抗体。
链交换工程结构域（SEED ）：S EED 异二聚化 是另一种基于空间突变的设计策略，该策略利用了从 IgG 和IgA CH3域（也称为AG SEED CH3和GA SEED CH3）衍生的交替序列的互补性。IgG和IgA CH3衍生物产生互补序列，因此 在组装两个互补的重链异 源二聚体 的同时 ，排除了缺乏互补性的同 源二聚体的组装。 研究表明，Fab-SEED 融合蛋白保留了与其他抗体相当的结合亲和力 ，以及良好的药代动力学和稳定性。
静电操纵相互作用：该策略用带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸取代 CH3 域中的一个残基 ，并用带正电荷的赖氨酸 取代对应另一个 CH3 域中的一个残基 ，以通过静电相互吸引促进重链异 源二聚体的形成 ，同时通过静电排斥抑制同 源二聚体的形成。
XmAb 双特异性平台：位点特异性突变通过避开重链问题可以显着提高双特异性抗体的质量和数量 ，但是空间突变和电荷对的引入会降低双特异性抗体的热稳定性。 XmAb 双特异性平台方法 可以通过结合静电相互作用，C H3 域构象和氢键提高 双特异性抗体的热稳定性。 具体的，该策略将天然 IgG1 的Fc侧链 突变交换为 S364K 和K370S异二聚体，以在两者之间形成氢键，然后进行L368D/K370S取代驱动盐桥相互作用以 促进异二聚体的形成。
总而言之，双特异性抗体重链异二聚化（尤其在CH3 区域内）包括多种设计策略，例如空间突变，静电操纵相互作用和重链电荷差异。些方法通常一起应用，以 在最少 量同源体 二聚体形成 的前提下实现双特异性抗体重链异二聚化。
2.2.3重链和轻链装配
尽管对Fc CH3 结构域进行修饰可实现正确的重链异二聚化，但使用两条不同的轻链仍会导致所需双特异性抗体的收率低（4种不同组合的产生，只有1种是双特异性 的）。 如Fig .3b 所示，通过轻链和重链 的正确配对以解决不当的重链和轻链相互作用问题，例如 公共轻链（common light-chain ）和CrossMab 技术等。这些策略通常与 上述Fc 修饰的重链结合使用 。
公共轻链技术：公共轻链技术可以与k nobs-into-holes 技术结合在一起组装 IgG 样双特异性抗体。 公共轻链策略的机制基于以下事实：从针对多种抗原的 噬菌体展示筛选中发现的抗体通常共享相同的 VL 结构域，这反映了噬菌体文库中 轻链库的大小非常有限。 公共轻链策略的使用简化 了工业生产中的抗体工程和纯化过程。例如， 对于2017 年被批准用于治疗A型血友病患者 的全长双特异性 IgG 样BsAb药物emicizumab ，其大规模生产是通过以下三种抗体工程策略的组合实现的： 一条公共轻链组装重链和轻链，改变两条不同重链的电荷以促进抗体纯化，以及对两条重链使用静电操纵技术以促进细胞中重链的表达 。当前已经开发了许多 公共轻链和 公共重链发现平台以使得能够有效产生用于 bsAb 组装的抗体。
CrossMab技术：与 公共轻链方法不同， CrossMab 技术通过交换 Fab 片段的重链和轻链结构域序列来解决轻链问题 ，该技术可产生多种双特异性抗体 （二价，三价和四价抗体 ），以及其他新型的基于 Fab 的抗体衍生物。 常见的三种 形式显示在 Fig. 3b 中 ：第一种用 占双特异性抗体一半的同源轻链（ CrossMab Fab ）简单地替换重链的整个Fab臂， 在保留结合亲和力 的同时有利于工程化 Fab 片段组装 ；第二种涉及 Fab 上的 VH 与相应的VL结构域（CrossMab VH-VL）交换，因此双特异性抗体两臂上的重链和轻链界面的分子结构不相同， 从而防止轻链错配 ；第三种 形式中双特异性抗体一只臂 上的 CH1 和CL也会互换，以在重链和轻链之间正确组装（CrossMab CH1-CL） 。罗氏的Vanucizumab 是首先使用的CrossMab CH1-CL方法被设计为靶向血管内皮生长因子（VEGF）-A和血管生成素-2（Ang-2）的双抗药物。
2.2.4共培养策略
为解决轻链错配问题并保留天然抗体结构， 研究者通过结合两种不同的半抗体来生产双特异性抗体 。如Fig .4 所示，该抗体在体外从两种不同的细胞系表达 ，在对两种半抗体纯化 后， 于体外以 1 ：1摩尔比混合以产生功能性双特异性抗体。这种半抗体方法使用两个单独的细胞系意味着在体外结合之前必须进行 两批培养，收获和纯化过程，这可能会增加成本和污染的风险。 为解决此问题，研究者在大肠杆菌体系和CHO 细胞体系中都开发出了共培养方法。
大肠杆菌体系：大肠杆菌中的质粒用包含不同半抗体基因（ A 和B）的质粒转化，该半抗体基因 经k nobs-into-holes 技术处理以防止重链在与轻链缔合之前发生 同源二聚化。培养后裂解细胞以收获半抗体。由于上述过程对于两种细胞系都是相同的，因此可以应用共培养策略降低风险和成本。两种 分别含有半抗体 A 质粒和半抗体B质粒的大肠杆菌 菌株以相同细胞数接种到相同容器中 培养，相同细胞数是确保最终产生相同量的抗体 A 和B的方法 ，这种方法 能够相对简单和稳定地设计和生产各种 双特异性抗体。
CHO细胞体系：CHO 细胞 体系也可以用于共培养方法，于大肠杆菌体系相似但在质粒设计，接种和收获 等方面 存在一些差异。对于 CHO 细胞，重链和轻链 需要通过单独的 DNA 质粒引入细胞中，以避免非同源重链和轻链配对，并确保足够的抗体效价。 同时，需要根据抗体效价和细胞生长速率，调整两种半抗体生产 CHO 细胞系的比例，以使摩尔比为1：1的半抗体A和B的产量最大化。在收获前，加入还原型谷胱甘肽（GSH）作为还原剂防止半抗体的同 源二聚化和二硫键的形成。
2.2.5IgG 样双特异性抗体的表达与生产
哺乳动物细胞是工业上生产IgG 的主要 表达系统，该平台 能生产满足临床和商业需求 的高滴度抗体。然而，双特异性抗体的产生更为复杂，并且通常需要至少两个用于异二聚化重链的质粒和一个用于 公共轻链的质粒 （如果使用两个不同的轻链 则需要两个轻链质粒 ）。 本文建议在单独的质粒上表达 HC 和LC，因为操纵质粒比率是一种针对所需产物优化蛋白质组装的简便有效的方法。随后，通常需要 经历复杂的过程从异质稳定转染池中选择最理想的克隆细胞系，以进行大规模抗体生产。 CHO 细胞因其高蛋白质生产率，低污染率和人体免疫相容性而闻名 ，稳定 CHO 细胞的抗体表达水平可以达到> 3 g/L，有时甚至> 5 g/L甚至更高 。但是 CHO 细胞的IgG样双特异性抗体产量较低，约为1-3 g/L甚至更低。
与稳定转染相比，瞬时转染无需将重组DNA 整合到宿主基因组中 因而可以 在几天内 快速获得结果。然而，由于生产双特异性抗体所需的质粒数量众多，与稳定的细胞系相比， IgG 的瞬时表达有时难以 达到标准，并且滴度相对较低。实际上，对于体内组装，工程化重链和轻链的有效共表达深深地依赖于稳定表达的细胞克隆的选择 ，在稳定细胞中共表达仍然是 IgG 样双特异性抗体生产的主要方法。
3.结论和展望
本文着重于双特异性抗体的设计，生产和质量。 关键的挑战是如何生产高质量的，副产物和杂质少的均匀双特异性抗体。对于不同类型的scFv 型双特异性抗体，蛋白质稳定性和组织穿透能力各不相同 。此外，有多种 表达系统可供选择， 而最合适的系统取决于特定的 scFv 抗体大小，氨基酸序列，蛋白质构象，溶解度，稳定性，纯化和可扩展性 等；对于 IgG 样全尺寸双特异性抗体，纯异源二聚体的生产是通过重链和轻链 的彻底异二聚体实现的。 Knobs-into holes 方法是将不同的重链关联的有效方法 ，共同轻链和 CrossMab 技术也是改变轻链和重链装配的 常用方法。共培养 策略和无细胞系统作为互补的生产平台出现， 使得研究者可以 更轻松地 生产双特异性抗体。
抗体领域中先进的蛋白质和生产工程技术促进了双特异性抗体及其衍生物的开发，这是增长最快的下一代抗体疗法之一。在双特异性抗体结构设计中，已经以scFv 和IgG样形式或通过使用两者的组合获得了多样性。此外，添加诸如适体，亲和体和合成药物之类的小分子可以进一步扩大其适用性， 以产生 更多新型的双特异性抗体相关产品。双特异性抗体广泛应用于免疫疗法以治疗癌症，未来通过不断努力以工业规模改进其设计，生产和纯化，双特异性抗体将在市场上占有越来越大的份额，并有 希望发挥其全部潜力 。
参考来源：
Wang Q, Chen Y, Park J, et al. Design and Production of Bispecific Antibodies[J]. 2019.
