【原】M6A-让病毒成为伪装者

M6A是真核生物RNA上最常见的修饰。病毒作为细胞内专性寄生生物，在寄主体内复制的时候，病毒的RNA也会被加上m6A修饰。有研究表明，病毒mRNA上的m6A可以促进翻译和mRNA的稳定性，但是，RNA病毒的基因组和反基因组上m6A的生物学功能还未知。2020年2月，俄亥俄州立大学兽医系李建荣课题组以人变位肺病毒（HMPV）为模型进行研究，发现m6A可以作为寄主识别“自我”和“非我”的标志，病毒基因组上的m6A修饰可以让病毒基因组伪装成寄主RNA，进而逃避免疫反应。

                                             

期    刊：nature microbiology

影响因子：14.3

发表时间：2020年2月

背景

病毒侵染寄主后，寄主首先会对病毒的核酸进行识别，区分是“自我”还是“非我”，如果识别为“非我”就会触发免疫反应。为了能够在寄主体内顺利生存，病毒RNA会有一些措施来模仿寄主RNA，比如在5^，末端加上帽子结构，这些措施帮助病毒RNA伪装成寄主RNA，被识别成“自我”，进而逃避免疫反应。本文以RNA病毒HMPV为研究对象，发现m6A是寄主识别“自我”还是“非我”的分子标记，缺乏m6A的病毒基因组会被RIG-1结合并诱导干扰素合成。

结果

HMPV基因组、反基因组和mRNA上均有m6A修饰。

作者从纯化的HMPV病毒中提取RNA，利用m6A-seq 检测HMPV基因组RNA和反基因组RNA上的m6A修饰情况，结果显示在基因组RNA和反应基因组RNA上分别检测到5和12个peak，其中信号最强的pean在G基因上。

从HMPV感染的A549细胞中提取mRNA进行m6A-seq，检测HMPV mRNA上m6A修饰情况，发现HMPV 的3个mRNA上有peak，其中G mRNA上的信号强。

HMPV基因组和反应基因组上m6A修饰分布

M6A修饰促进HMPV 复制和基因表达

M6A修饰相关蛋白中，writer（METTL14和METTL3）蛋白加上m6A修饰， eraser（ALKBH5 和 FTO).）蛋白去除m6A修饰， m6A结合蛋白（YTH 家族蛋白）调节m6A的功能。作者发现过表达m6A结合蛋白可以增加病毒G蛋白和N蛋白水平，同时还可以增加病毒粒体、反基因组、N mRNA和G mRNA的释放。过表达wrier 蛋白和敲除eraser蛋白也得到同样的效果，敲除m6A wrier 蛋白和过表达eraser蛋白则抑制病毒蛋白的翻译。

胞质包涵体是HMPV病毒复制和核糖核蛋白（RNP）组装的场所，作者发现，RNP的成分N蛋白与METTL14有很强的共定位，与METTL3和m6A结合蛋白有部分共定位，与ALKBH5没有共定位。这些结果说明病毒m6A修饰在HNPV病毒复制过程中发挥重要的促进作用。

N蛋白与METTL14共定位

获得缺乏m6A的重组HMPV病毒

为了进一步研究m6A的功能，作者构建了重组HMPV病毒（rHMPV），并通过两种方式获得缺乏m6A的重组病毒（m6A-deficient rHMPV）：在rHMPV上突变G基因组、G反基因组和G mRNA上的m6A修饰位点得到一系列rHMPV 突变体以及在细胞系中过表达ALKBH5得到“天然”缺乏m6A的rHMPV（rHMPV-ALKBH5）。利用这些病毒和病毒RNA进一步研究m6A的作用。

缺乏m6A导致病毒弱化

与rHMPV相比，所有的rHMPV 突变体在细胞系内均表选出弱化、复制缺陷，蛋白合成量低，突变的m6A位点越多，这种现象越明显。另外，rHMPV突变体更早出现细胞病变反应。

缺乏m6A的病毒诱导高水平的IFN-1

m6A-deficient rHMPV诱导更多的IFN-1。病毒侵染会引起免疫相关基因表达量的改变，因此作者研究了rHMPV突变体侵染后I型干扰素（IFN-1）的动态变化，发现所有的rHMPV突变体诱导的IFN-α和IFN-β都显著高于rHMPV，并且突变位点越多，诱导水平越高。

m6A-deficient反基因组和基因组，而不是G mRNA诱导高水平的IFN-1。从病毒侵染的细胞或者病毒粒体中分离出RNA，侵染A549细胞。结果显示，从rHMPV突变体侵染细胞中分离的RNA比从rHMPV侵染细胞中分离的RNA诱导更多的IFN-β。而单纯的G mRNA侵染后只诱导少量的IFN-β。进一步从纯化的病毒粒体中分离出病毒基因组和反基因组进行侵染细胞，发现来自rHMPV突变体的RNA诱导更多的IFN，而用CIP处理后，这种诱导就消除了。突变位点越多，诱导IFN-1的水平越高，这明缺乏m6A的反基因组和基因组诱导IFN-1的水平跟m6A缺乏的程度相关。

m6A-deficient反基因组和基因组诱导高水平IFN-1

RIG-1在诱导IFN-1和NF-κB上起关键作用。为了研究是哪个RNA感应器在识别缺乏m6A的RNA，作者在细胞系中分别敲除RNA感应器RIG-1和MDA5以及下游蛋白MAV5，用m6A-deficient rHMPV侵染后检测IFN-β的产量。结果显示m6A-deficient rHMPV在敲除RIG-1和MAVS的细胞系中，对IFN-β的诱导完全消除，但是在敲除MDA5的细胞系中仍然可以诱导水平的IFN-β，用m6A-deficient 病毒RNA也得到同样的结果。除此之外，跟IFN有关联的NF-κB也被m6A-deficient病毒和m6A-deficient病毒RNA诱导。

缺乏m6A的病毒RNA促进RIG-1的表达，并且通过RIG-1构象改变或者增加与RIG-1的亲和力，促进IFN的产生。与rHMPV相比，m6A-deficient 病毒和病毒RNA侵染细胞后，RIG-1的表达量显著升高。利用胰蛋白水解酶检测发现m6A-deficient 病毒RNA能够促进RIG-1构象改变。Pull down实验和体内RNA竞争结合试验发现，m6A -deficient 病毒RNA能够拉下更多的RIG-1蛋白，并且m6A -deficient病毒mRNA跟RIG-1的亲和力 跟rHMPV病毒RNA差不多。而用CIP处理后，这些现象都消除了，说明这些现象跟基因组RNA 5^，的三磷酸结构相关。

缺乏m6A的病毒RNA增加与RIG-1的亲和力

敲除RIG-1或者MAVS的细胞系中，m6A -deficient rHMPV复制恢复。如果RIG-1确实能够识别“非我”的RNA，那在敲除RIG-1或者MAVS后，m6A -deficient rHMPV在细胞中的复制会恢复。作者对此进行的验证，发现无论是病毒复制能力还是细胞病变情况，敲除RIG-1或者MAVS后都得到改善。结合之前的结果，说明内在免疫反应和病毒蛋白水平的降低导致了m6A -deficient rHMPV的弱化。

m6A-deficient 反基因组促进IRF3的磷酸化。干扰素调节因子3（IRF3）和IFN有级联关系，实验发现m6A-deficient病毒和RNA侵染均能增加IRF3的磷酸化，但CIP处理后这种现象就消除了。IRF3磷酸化的增加跟IFN-1的增加是一致的。

RIG-1介导的IFN信号通络

体内实验验证

利用大鼠模型，验证了m6A -deficient rHMPV可以在体内诱导高水平的IFN-1，并且发现m6A -deficient rHMPV在大鼠体内虽然失活，但是能产生抗体。这意味着本文的结果可以运用到疫苗开发中。

M6A -deficient rHMPV 可以产生抗体

总结

Autumn

本文发现，m6A修饰可以使病毒RNA伪装成寄主RNA逃避免疫反应，m6A可以是弱化病毒的靶标，运用到HMPV疫苗开发中。