原理核酸在中性条件下,磷酸基解离带负电荷,这一部分由于水合化溶于水．在酸性条件下,磷酸基的负电消失,水溶性下降．因此,在酸性酚处理下,DNA
向疏水性的酚层移动,由于RNA有OH的存在有亲水性,因此向水层移动．异硫氢酸胍(GTC)使RNA酶失活并将蛋白质变性,可溶于酚中.
因此,水层中只含有RNA．离心后用盐溶液和醇沉淀就可得到纯净的RNA．试剂盒1.0.75M枸橼酸钠PH7.0A液：二水柠
檬酸三钠（sodiumcitrate,C6H5Na3O7.2H2O）：2.94g?柠檬酸（Citricacid，C6H8O
7）：1.92g?或二水柠檬酸（C6H8O7.H2O）：2.10g?加超纯水至10ml配成1M枸橼酸钠溶液B液:Citric
acidC6H8O71.92g?或C6H8O7.H2O2.10g?加超纯水至10ml配成1M枸橼酸溶液?加B液0.25-
0.50ml至A液中,调PH值至7.0?超纯水稀释至0.75M．加水至13.33ml2.10%十二烷基肌氨酸钠(Sodiu
mN-lauroylsarcosine,Sarcosyl)1g,加超纯水至10ml.3.变性液?50g异硫氰酸胍加至58
.6ml蒸馏水中后，依次加入0.75M枸橼酸纳、5.28ml10％Sarcosyl。?加热至60-65℃直至完全溶解。
?注：使用前50ml变性液加0.35ml的2－ME。4．2M乙酸钠PH4.0?NaOAC.3H2O6.8g?DEPC
水7ml?冰乙酸约14ml?调PH值至4.0?加DEPC水定容至25ml5.水饱和酚6.CIA氯仿：异戊醇＝24：17.
工作液变性液：乙酸钠：水饱和酚＝10：1：10二．步骤1．加100mg组织至1ml工作液中，匀浆。2．加CIA0
.2ml,盖好充分混匀。3．15000转／分，4oC,离心20分钟。4．取上清，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分
钟。（这一步可放置－20oC保存半年。）5．15000转／分，4oC,离心10分钟。6．弃上清，加入0.3ml变性液，0
.3ml异丙醇。－20oC保存20分钟（可保存半年）。7．15000转／分，4oC,离心10分钟。8．其上清，加入75％
乙醇1ml（DEPC水稀释），盖盖，室温10－15分钟。9．15000转／分，4oC,离心5分钟。10．超镜台内室温下自
然干燥，将RNA溶于20－50ulDEPC水中。11．取5ulRNA溶液，稀释100倍后用A260/A280紫外光测
定RNA纯度并测量。A260/A280OD值的比值处于??1.7-2.0之间。剩余RNA保存1．3M乙酸钠PH5.
2?NaoAC.3H2O10.2g?DEPC水7ml?冰醋酸约10ml?调PH至5.2?加DEPC水至25ml2.
核酸水溶液的1/10量3M醋酸钠。3.核酸水溶液等体积的异丙醇。4.－20oC保存。(最长半年) |
|
