泛癌免疫基因组分析揭示基因型与免疫表型的关系和检查点阻断反应的预测因子Pan-cancer Immunogenomic Analyses Reveal Genotype-Immunophenotype Relationships and Predictors of Response to Checkpoint Blockade研究背景1、免疫治疗正在改变的晚期肿瘤的治疗情况，但仍有很多患者对免疫治疗没有好的反应。 本文通过对基因组的数据进行分析，描述肿瘤内免疫细胞的浸润情况，进而发现其中基因与免疫表型的关系，并预测免疫治疗的效果。 全文概要 1.jpg 上图示本文基本框架，通过对TCGA数据库中的数据进行分析，提取肿瘤中淋巴细胞浸润、新抗原和CGAs（肿瘤-种系抗原）的信息，并将结果存放在TCIA数据库中，对其中的免疫表型信息进行分类，计算免疫表型评分。然后在肿瘤组织中进行验证，先进行RNA测序，将测序结果用前面的方法进行免疫表型评分，根据免疫表型评分的情况作出相应的免疫表型图，并发现表现出左边这种免疫表型的肿瘤免疫治疗好，表现为右边这种免疫表型图的患者免疫治疗的效果欠佳。 肿瘤免疫的高分辨率基因组分析 2.jpg 免疫基因组学分析和用于分析的数据类型 泛癌免疫基因组学分析的流程图：首先从TCGA数据库和抗CTLA4、PD-1单抗的临床试验中提取生存信息、SNP array （单核苷酸多态性微阵列）、WES（全外显子组测序）和RNA测序的数据，对数据进行挖掘，提取HLA allele（人类白细胞抗原等位基因）、克隆或亚克隆的突变信息，由新抗原和肿瘤-种系抗原（ CGAs ）组成的肿瘤抗原基因组信息，还有TILs和免疫表型信息。TILs，肿瘤浸润淋巴细胞的信息是通过GSEA和反褶积两种方法从基因表达数据中估计。免疫表型，使用TILs和预先确定的基因集(MHC分子、免疫刺激因子和免疫抑制剂)来定义。分析的结果放在可通过网络访问的数据库The Cancer Immunome Atlas（TCIA）中。  3.jpg 免疫相关特征数据处理过程 免疫相关的特征数据来源于纯化的免疫细胞，正常组织和肿瘤细胞系的表达谱，并用TCGA RNA测序数据的基因集富集分析（GSEA）后得到，分析的结果放在TCIA数据库中。 免疫浸润的细胞特征揭示了与不同肿瘤的预后相关的细胞类型 4.jpg 肿瘤浸润免疫细胞类型与预后的关系。 如A图示ssGSEA作的气泡图，图中展示了19种实体瘤的免疫细胞亚群。最上面这排是19种实体瘤，左边是缩写，右边图例显示他们的全称，最左边这列是免疫细胞亚群。其中圆圈的大小指其中富集的样本量大小，蓝色表示与生存期呈正相关，红色表示与生存期呈负相关。不难发现，不同肿瘤中，与生存相关的细胞结构是不同的。 一般而言，与适应性免疫相关的许多TIL亚群的浸润与良好的预后相关，比如活化的CD8 + T细胞，Tcm （central memory）（中枢记忆）和Tem（effector memory）（效应记忆） CD8 +细胞和Tem CD4 +细胞， 而MDSC（骨髓源性抑制细胞）和Tregs（调节性T细胞）与不良预后相关。 突变负荷和组织环境决定免疫浸润细胞的组成  5.jpg 突变负荷对免疫浸润细胞组成的影响  6.jpg 在特定肿瘤中，不同突变组的TIL组成不同。 这里最左边的三个分组分别是高突变、中突变和低突变负荷组，最上面这行指的是19个肿瘤，可以发现，在同一个肿瘤中，在不同突变负荷组内，TIL的组成是不同的。  7.jpg 和前面的图类似，这里分析的是在肿瘤中富集的免疫细胞亚群，在不同突变负荷组内的TIL组成情况。在各个肿瘤中富集的免疫细胞亚群，在不同突变负荷组内的TIL组成也是不同的。  8.jpg 使用降维技术分析肺腺癌中淋巴细胞亚群， （左图）用平均归一化富集评分[NES] 分析所有淋巴细胞类型，（右图）用t-SNE分析选定的几个细胞亚群，与免疫抑制相关的亚群(MDSCs （骨髓源性抑制细胞）、Tregs)与效应因子功能相关的亚群(活化的T细胞、Tcm细胞、Tem CD4+和CD8+细胞)在空间上是分离的。  9.jpg 在肿瘤进展的不同阶段有不同的免疫细胞浸润模式。 基于来自GSEA的NES评分计算的肿瘤I期至IV期肿瘤的免疫细胞类型的富集（蓝色）和耗竭（黄色）情况的火山图。蓝色代表细胞富集，黄色代表细胞耗竭。Tem CD8+T细胞在I期和II期肿瘤中富集，在III期和IV期肿瘤中是耗竭的。相反，Tregs和MDSCs在早期肿瘤中减少，在晚期肿瘤中增加。相应的，与适应性免疫相关的TIL亚群的富集从I期降至IV期，而与固有免疫相关的TIL的富集从I期增加至IV期。这表明免疫细胞成分在肿瘤进展过程中向免疫抑制表型转移。 这些分析表明，基因组谱和特定的组织背景都对免疫浸润的细胞组成有影响。同时，这个研究结果也支持了肿瘤进展过程中免疫系统也在进化这个观点。 CGAs与CD4+和CD8+T细胞浸润相关 10.jpg 肿瘤抗原有可能引发肿瘤特异性的免疫反应，主要由CGAs和新抗原构成。 CGAs是一种通常由生殖系细胞表达但在肿瘤细胞中有异常表达的蛋白，而新抗原则是由基因编码序列的突变或重新排列引起的。上图为从CT数据库（www.cta.lncc.br）获得的肿瘤种系抗原（CGAs）列表。这些CGAs中很多抗原的肿瘤特异性比较低，所以作者选择了60个根据以前的报道，可能被T细胞靶向攻击的CGAs进行分析。  11.jpg CGAs与实体瘤中Tem和/或Tcm CD8+ /CD4+细胞的活化显著相关。 据既往研究我们可以知道，细胞溶解活动和细胞表面表达的CGAs数量之间没有明确的正相关关系，即不是肿瘤细胞表面的CGAs（肿瘤-种系抗原）数量越多，肿瘤细胞越容易死亡。本文中，作者研究了CGA和T细胞活化之间的关系。 12.jpg CGA评分与肿瘤间的突变负荷呈正相关。 这些在肿瘤中高表达的CGAs其实就是潜在的免疫治疗靶点。作者预测了这些CGAs中与HLA分子结合的肽段，从而产生5775个独特的肽段。 然后，通过计算CGA表达评分(实验程序)来估计抗原载量。上图对CGA表达评分和肿瘤突变的关系进行了分析，横坐标是各个肿瘤，按肿瘤突变负荷从低到高排列；纵坐标是CGA表达评分。 新抗原景观多样而稀疏 13.jpg 新抗原的数量与突变负荷相关。 横坐标指各个肿瘤，从左到右肿瘤突变负荷越来越高，纵坐标指新抗原的数量，很明显，新抗原的数量和肿瘤突变负荷呈正相关。 14.jpg 每个突变产生的新抗原数量因肿瘤而异。 横坐标也是指各个肿瘤，纵坐标是新抗原和突变数的比值，即每个突变产生的新抗原数量；图中可见各个肿瘤中，每个突变产生的新抗原数量是不一样的，范围从黑色素瘤[SKCM]的0.93到肾细胞癌[KIRC]1.43不等。肿瘤之间的这些差异可能是由突变过程的差异导致。 前面这一系列的实验说明，新抗原负荷以及CGA负荷和选定基因和免疫细胞亚群之间的关系在不同肿瘤中不是固定不变，而是高度可变的，这说明免疫应答可能受这两种抗原的联合作用控制。 15.jpg 不同肿瘤阶段的新抗原负荷。 这里展示的是不同肿瘤阶段的新抗原负荷，出乎意料的是，所有肿瘤从I期到IV期的新抗原载量仅仅是略有增加。 16.jpg 实体肿瘤中共有的新抗原。 此图展示的是实体瘤中各个患者共有的新抗原情况，方块仅显示在至少5％的肿瘤患者中共有的新抗原。THCA、PAAD、SKCM肿瘤患者中新抗原共享稍多，其他肿瘤中共享的抗原较少。所以，总体而言，新抗原很少在患者之间共享。 17.jpg HLA（人类白细胞抗原）分层的共享新抗原。 最上面是各个类别的HLA，最右边是各种新抗原。作者分析了911,548种独特的新抗原中的共享新抗原，只有图中展示的24种新抗原在至少5%的一种或多种肿瘤患者中共享。 我们可以发现，最常见的新抗原是由PIK3CA 、 RAS和BRAF等驱动基因突变引起的。其中，只有两种新抗原在一种肿瘤类型中超过15%的患者中共享：KIGDFGLATEK在甲状腺癌(THCA)和SKCM中的共享，KLVVVGADGV在PAAD中的共享。因此，新抗原是高度稀疏的，很少在肿瘤患者中共享。 肿瘤的基因型决定免疫表型和肿瘤逃逸机制从前面的研究可以知道，高突变负荷的肿瘤中，效应T细胞富集可能是抗原负荷较高导致的。作者进一步提出，免疫表型与描述肿瘤基因组复杂性的其他基因组特征，比如肿瘤异质性（高与低）和抗原性（高与低）之间有没有关系，如果有，其中有着什么样的关联。 18.jpg 异质性强的肿瘤突变负荷略低，但富含活化的T细胞和Tem细胞，并且免疫抑制细胞耗竭。 19.jpg 类似的，新抗原频率较高的肿瘤突变负荷略低，富含活化的T细胞和Tem细胞，并且免疫抑制细胞呈耗竭状态。 20.jpg THCA的基因型与特异性免疫表型相关。 作者选择了具有最低和最高突变负荷的两种肿瘤，即THCA和SKCM两种肿瘤，并分析了它们在不同基因型中的免疫表型。上图示THCA肿瘤中，BRAF-和RAS-突变的免疫细胞组成的情况。最上面的图例指BRAF-和RAS-突变两种基因型分类，右边是免疫细胞。从图中可见，在THCA肿瘤中，不同的基因型中免疫的细胞组成不同，即免疫表型不同。 21.jpg 不同的基因突变表现出明显不同的免疫浸润细胞模式。 基于来自GSEA的NES评分计算的火山图，显示TCHA肿瘤中，BRAF-与RAS-突变时免疫细胞浸润的情况。以BRAF突变为主时，MDSC等与免疫抑制相关的细胞富集，Tem等等与免疫活化相关的细胞呈衰竭状态。 22.jpg 在BRAF-和RAS-突变的TCHA肿瘤中MHC和免疫调节分子的表达。 其中， BRAF突变的肿瘤主要浸润免疫抑制细胞，而RAS突变的肿瘤则下调MHC分子和免疫调节分子。这说明MHC、免疫刺激分子和免疫抑制分子的表达水平也与基因型有关，提示BRAF突变和RAS突变的THCA肿瘤有不同的肿瘤逃逸机制。 23.jpg SKCM肿瘤中，基因型与不同的免疫表型相关。 图4（I）基于来自GSEA的NES得分计算的SKCM肿瘤中，各基因型细胞浸润情况的火山图。同样的，不同基因型中免疫细胞的浸润情况也是不一样的，比如BRAF型的肿瘤富含效应T细胞，而其他基因型富含Treg等免疫抑制细胞。 24.jpg SKCM肿瘤不同基因型的新抗原负荷（突变负荷）。 在SKCM队列中，不同基因型肿瘤的新抗原负荷不同，因此作者推测突变负荷可能也会对免疫浸润情况产生影响。 25.jpg 同样的，SKCM肿瘤中，四种基因型与MHC和免疫调节分子表达情况也有明显差异。 以上的这些研究结果提示肿瘤的基因型决定了免疫表型和肿瘤的逃逸机制。 机器学习确定了实体瘤中肿瘤免疫原性的主要决定因素26.jpg 肿瘤与各类免疫相关的因素的关系。 这里分析了各种免疫相关因素和肿瘤的关系，免疫相关因素指左边这一列，作者将免疫相关因素分为四类，包括:(1) MHC I类、II类、非经典分子的表达; (2)某些共抑制和共刺激分子的表达；（3）活化的CD8 +/CD4+ T细胞和Tem CD8+ /CD4+细胞浸润; (4)免疫抑制细胞(Tregs和MDSCs)浸润。 27.jpg 免疫表型图 为了更好地显示免疫相关因素和肿瘤的关系，作者构建了免疫表型图。表型图内环的4部分分别指4大类免疫相关因素，包括MHC分子，免疫调节剂，效应细胞(激活的CD8+T细胞和CD4+T细胞，Tem CD8+和Tem CD4+细胞)和抑制细胞（Tregs和MDSCs）。外环示各个免疫因素对应的基因表达情况。28.jpg 免疫表型评分与12种实体瘤的生存相关 作者根据免疫表型图中代表性基因或基因组的表达计算了一个综合评分，即免疫表型评分。分析显示，免疫表型评分与12种实体瘤的生存相关，其中4种肿瘤具有显著相关性：KIRC、SKCM、乳腺癌(BRCA)、膀胱癌(BLCA)。 免疫表型评分预测CTLA-4和PD-1阻滞剂的治疗效果29.jpg 抗CTLA-4抗体治疗个体患者的免疫表型图 在此研究的患者中，与肿瘤内的平均表达相比，MHC上调，显示为红色，CP部分下调，显示为蓝色。但是有效和无效的患者MHC上调和CP下调的程度是不一样的，颜色深浅不同。 30.jpg 抗CTLA-4抗体治疗个体患者中，对免疫治疗有反应的患者细胞毒细胞(CD8+T细胞、Tγδ细胞、NK细胞)富集，和免疫抑制相关的MDSCs和Tregs呈耗竭状态。 31.jpg 应答者和非应答者的免疫表型评分明显不同。 纵轴指免疫表型评分，横轴根据对免疫治疗的反应情况分成3个色块，从图中可见，应答者和非应答者的免疫表型评分明显不同，这使从免疫表型图分析得出的免疫表型评分能够区分对免疫治疗有效和无效的患者。 32.jpg IPS（免疫表型评分）对于治疗有效率具有更好的预测能力 33.jpg 抗PD-1免疫治疗的患者中，免疫原性的决定因素在反应者和非反应者两组人群中表现出不同的表达模式。 34.jpg 抗PD-1免疫治疗的患者中，有效者的肿瘤富含细胞毒性细胞（CD8 + T细胞，Tgd细胞，NK细胞）并耗尽MDSC和Tregs。 35.jpg 抗PD-1免疫治疗的患者中，免疫表型评分可以将对免疫治疗有无应答的患者进行分层。 36.jpg IPS（免疫表型评分）对抗PD-1抗体治疗的患者也有较好的预测能力。 欢迎关注 |
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