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摘 要： 原发性肝癌作为一种恶性肿瘤，多年来手术切除治疗效果差并且复发率高，化疗等综合治疗效果也不尽如人意[1]。肝癌的发病率在全国乃至世界范围内都呈逐年增高的趋势[2]。寻找对肝癌敏感且低毒副作用的药物，成为目前肝癌治疗研究的重要内容。米仔兰Aglaiaodorata Lour是一种民间常用中药，具有祛风湿、散瘀肿的功效，主治风湿关节痛、跌打损伤、痈疽肿毒[3]。近年来，研究人员发现米仔 1 材料 1.1 细胞 人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞（L02）购于中国科学院上海细胞库。 1.2 药品和试剂 洛 1.3 仪器 311型气套二氧化碳培养箱（美国Thermo FisherScientific公司）；BSC-1000IIA2生物安全柜（上海博迅实业有限公司）；CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）；Easy pureII实验试剂超纯水仪、DioFuge PRIMO型台式高速离心机、−80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Spectra Max Plus 384酶标仪（美国Molecular Devices公司）；Milli-Q labconco纯水仪（美国MilliPore公司）；激光共聚焦显微镜（德国Leica Microsystems公司）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；Mini-Protean@ Tetra电泳槽、ChemiDOCTM XRS＋分子成像系统（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 细胞培养 HepG2和L02细胞株复苏后，HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，L02用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，置于细胞培养箱（37 ℃、5% CO2、相对湿度95%）培养。每2～3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。 2.2 MTT法检测细胞活力 存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白) 2.3 细胞克隆形成实验 取对数生长期HepG2细胞，每孔接种800个细胞于6孔培养板，每组设3个复孔，置37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后加药，使洛克米兰醇的终浓度为0、30、120、480 nmol/L，给药48 h后，弃去含药培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，加入新鲜不含药培养基继续培养8 d。在倒置显微镜下观察并记录每组细胞克隆数目，细胞数大于50的克隆记为1个细胞克隆。计数后弃去培养基，PBS洗涤2次后，用4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色30 min后流水冲洗，拍照。计算克隆形成率。 克隆形成率＝细胞克隆数/接种细胞数 2.4 EdU染色 取对数生长期HepG2细胞，以每孔1×105个细胞接种于激光共聚焦平皿中，培养24 h后，给药组分别给予30、120、480 nmol/L的洛克米兰醇，药物孵育36 h后，加入EdU（终浓度为10 μmol/L）溶液，与药物继续共同孵育8 h。弃培养基；PBS清洗细胞1～2次，将未渗入DNA的EdU洗脱掉。按照试剂盒操作固定细胞并染色，将激光共聚焦平皿置于激光共聚焦显微镜下，以550 nm激发波长，565 nm发射波长拍照，被标记的细胞为红色，未标记的细胞为蓝色。用软件统计被标记的细胞数目。 细胞增殖率＝标记的细胞数/(标记的细胞数＋未标记的细胞数) 2.5 CFDA-SE染色 按照试剂盒的说明将HepG2细胞标记CFDA-SE，将标记了CFDA-SE的细胞混匀置于6孔板中，每孔2×105个细胞，培养24 h后给药组分别给予终浓度为30、120、480 nmol/L的洛克米兰醇。药物孵育48 h后收集细胞。将细胞上清液收集于离心管中，用冷的PBS洗涤细胞2次，用FACS Calibur流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度，用FlowJo软件处理结果。 2.6 细胞凋亡检测 取对数生长期的HepG2细胞，调细胞数为1×105个/mL接种于6孔培养板，24 h后给药。给药组加入含不同浓度（30、120、480 nmol/L）洛克米兰醇的培养基，给药组和对照组各设3个复孔，48 h后收集细胞，按Annexin V-FIT-C/PI 双染细胞检测说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 2.7 细胞周期检测 。 2.8 Western blotting法检测相关蛋白表达 取对数生长期的HepG2细胞，以1×106个/mL的密度接种于培养皿。按照“2.7”项下方式给药，收集细胞，预冷PBS洗涤2次，加入Western blotting及IP细胞裂解液，冰上裂解5 min，12 000 r/min 离心20 min，吸取上清液，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。加入适量2×蛋白上样缓冲液，于100 ℃水浴10 min，−80 ℃保存备用。取出 2.9 MAPK抑制剂作用实验 取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞浓度为每孔4 000个，每孔接种190 μL于96孔板培养，常规培养24 h，给药前MAPK抑制剂组以及洛克米兰醇联合MAPK抑制剂组加入终浓度20 μmol/L ERK抑制剂U0126或 20 μmol/L JNK抑制剂SP600125孵育1 h，给药组其后加入含480 nmol/L 洛克米兰醇的培养基。于37℃分别培养48 h后弃去培养液，然后按照“2.2”项下方式方法处理。取对数生长期的HepG2细胞，以1×105个/mL的密度接种于6孔培养板培养。先用无血清的DMEM培养基处理HepG2细胞24 h使处于细胞周期不同阶段的细胞达到同步化。给药前MAPK抑制剂组以及洛克米兰醇联合MAPK抑制剂组加入终浓度20 μmol/L ERK抑制剂U0126孵育1 h，给药组其后加入含480 nmol/L洛克米兰醇的培养基。于37℃分别培养48 h后弃去培养液，然后按照“2.7”和“2.8”项下方式方法处理。 2.10 数据统计 所有数据以表示，采用SPSS 22.0进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间用t检验检测显著性。 3 结果 3.1 洛克米兰醇对人肝癌细胞HepG2或正常肝L02细胞存活率的影响 用于L02细胞的IC50值为（441.69±43.83）nmol/L。阿霉素作用于HepG2细胞在48 h的IC50值为（559.32±40.43）nmol/L，作用于L02细胞的IC50值为（164.62± 3.2 洛克米兰醇对人肝癌细胞HepG2增殖的影响 EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期（S期）代替胸腺嘧啶（T）渗入正在合成的DNA分子中，可直接并准确地检测出DNA复制活性[15]。实验结果如图2-A所示，图中红色的细胞为EdU标记的细胞，表示处于增殖状态的细胞。蓝色的细胞表示总的细胞。图片重叠后粉色的细胞表示处于增殖状态的细胞。使用软件处理统计后发现，对照组的细胞增殖率为（61.78±3.90）%。给予30、120、480 nmol/L洛克米兰醇后各组的细胞增殖率分别为（36.24±1.27）%、（29.38±1.99）%、（1.96±0.03）%。与对照组比较，随着洛克米兰醇作用于HepG2细胞的药物浓度的增加，增殖细胞的比例逐渐减少，差异显著（P＜0.01）。 CFDA-SE标记细胞的荧光非常均匀和稳定，每分裂一次子代细胞的荧光会减弱一半，细胞分裂次数越多，平均荧光强度越低[16]。实验结果如图2-B所示，洛克米兰醇在30、120、480 nmol/L的平均荧光强度为对照组的1.66、2.12、3.09倍。与对照组比较，随着洛克米兰醇作用于HepG2细胞的药物浓度的增加，平均荧光强度逐渐增加，差异显著（P＜0.01）。 细胞克隆形成实验是评价药物敏感性的金标准。实验结果如图2-C所示，洛克米兰醇在30、120、480 nmol/L剂量下HepG2细胞的克隆形成率分别为（69.42±8.07）%、（18.95±4.92）%、（9.61±2.18）%。与对照组比较，随着洛克米兰醇作用于HepG2细胞的药物浓度的增加，细胞克隆数目和大小逐渐减少，差异显著（P＜0.01）。以上结果表明洛克米兰醇能够剂量依赖性地抑制HepG2细胞增殖，其抑制HepG2细胞增殖的活性可能与其抑制细胞DNA合成有关。 3.3 洛克米兰醇对人肝癌HepG2细胞周期和细胞凋亡的影响 结2.76）%。在480 nmol/L洛克米兰醇作用24、48、72 h时，G2/M期细胞比例分别为（28.04±3.41）%、（38.24±4.08）%、（31.85±3.37）%。表明洛克米兰醇诱导了HepG2细胞G2/M周期阻滞，并且在48 1.70）%，结果表明洛克米兰醇可以浓度依赖性诱导HepG2细胞G2/M周期阻滞。同时探索了洛克米兰醇对HepG2细胞的抗增殖机制是否与细胞凋亡有关，结果如图3-C所示，在48 h时，与对照组相比，各浓度洛克米兰醇组细胞凋亡率未发生显著变化，该结果表明在48 h以内，洛克米兰醇没有诱导HepG2细胞凋亡。 3.4 洛克米兰醇对调控G2/M细胞周期相关蛋白的影响 结果如图4-A所示，在480 nmol/L洛克米兰醇作用24、48、72 h时，洛克米兰醇可以时间依赖性显著抑制cdc25C、cdc2和cyclinB1蛋白的表达。同时考察在48 h时不同浓度洛克米兰醇对周期蛋白表达的影响，结果如图4-B所示，洛克米兰醇可以浓度依赖性显著抑制cdc25C、cdc2和cyclinB1蛋白的表达。因此，推测洛克米兰醇可能通过浓度和时间依赖性显著抑制cdc25C蛋白的表达从而导致cdc2/cyclin B1复合物的活性受抑制，进而引起HepG2细胞G2/M周期阻滞。 3.5 洛克米兰醇对人肝癌HepG2细胞MAPK信号通路相关蛋白表达的影响 3.6 MAPK信号通路在洛克米兰醇诱导的HepG2细胞G2/M细胞周期阻滞中的作用 为了明确ERK和JNK通路激活在洛克米兰醇诱导的HepG2细胞抗增殖作用，用JNK抑制剂SP600125和ERK的抑制剂U0126来研究激活ERK和JNK与洛克米兰醇诱导的HepG2细胞抗增殖是否有关联。结果如图6所示，MTT检测结果显示，U0126预处理洛克米兰醇 480 nmol/L组细胞存活率较480 nmol/L洛克米兰醇单独处理组显著升高（P＜0.05）；而SP600125预处理洛克米兰醇480 0.05）。Western blotting结果显示与480 nmol/L洛克米兰醇处理组相比，U0126预处理洛克米兰醇480 nmol/L组G2/M期相关蛋白cdc25C和cdc2的表达。 4 讨论 目前，化疗药物杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有较强的细胞毒性作用。阿霉素是治疗肝癌的常用化疗药物，由于其有严重的心脏毒副反应限制了其在临床上的应用[17]。因此，继续从天然产物中寻找疗效更好、毒副反应更小的治疗肝癌的化合物是目前的研究热点之一。洛克米兰醇是从传统中药米仔兰植物分离得到的天然化合物，已有研究发现洛克米兰醇对乳腺癌[13]、前列腺癌[13]和白血病癌细胞[14]有显著的抑制效果，并且对正常细胞[10-12]的毒性较小。本研究也发现洛克米兰醇对HepG2细胞有显著的抑制作用，对L02细胞的毒性较小。对洛克米兰醇和传统化疗药阿霉素抑制肝癌细胞的效果和对正常肝细胞的毒性评价发现，洛克米兰醇在抑制HepG2细胞增殖的效果和对L02细胞选择性优于阿霉素。表明洛克米兰醇是一个潜在的治疗肝癌的化合物。 为了阐明洛克米兰醇抑制肝癌细胞HepG2的分子机制，采用细胞克隆、CFDA-SE和EdU实验方法发现洛克米兰醇能够抑制HepG2细胞DNA的合成，对HepG2细胞造成不可逆转的损伤。有研究表明洛克米兰醇能够在前列腺癌细胞（LNCaP）引起G2/M细胞周期阻滞和细胞凋亡[13]。Song等[14]研究发现洛克米兰醇可显著抑制致癌基因Fli-1的表达从而诱导恶性白血病细胞凋亡。Yuan等[18]研究发现FL3（洛克米兰醇溴代物）可通过抑制Akt和PHB的相互作用激活GADD45α引起尿路上皮癌细胞G2/M细胞周期阻滞。本研究证实洛克米兰醇主要通过引起HepG2细胞G2/M细胞周期阻滞起到抗增殖的效果。Cdc2 (CDK1)-cyclinB1复合物又称有丝分裂促进因子（maturation promotingfactor，MPF），是G2/M期检验点的关键调节因子，当细胞在G2期遭受DNA损伤时，G2/M期DNA损伤检验点就会抑制MPF的活性而防止细胞进入有丝分裂[19]。在许多肿瘤细胞中，cdc2和cyclinB1会过表达，cdc2和cyclinB1过表达往往导致细胞周期进程发生紊乱，恶性增殖，形成肿瘤[20]。本研究同时采用Western blotting方法证实洛克米兰醇能够显著抑制cdc2和cyclin B1的表达，这使得cdc2/cyclin B1复合物的形成显著减少，从而使HepG2细胞阻滞在G2/M期。Cdc25C磷酸酶是一种细胞周期调控蛋白，在调控G2/M细胞周期中具有重要的作用[21]。Cdc25C能使cdc2第14位的苏氨酸（Thr14）和第15位的酪氨酸（Tyr15）去磷酸化，从而激活cdc2[22]。在有丝分裂开始时cdc2/cyclin B1在核中被cdc25C完全活化，促进细胞从G2期进入M期。当cdc25C活性受抑制时，cdc2/cyclinB1复合物的活性也将受抑制，发生G2/M期阻滞[23]。本研究发现洛克米兰醇可显著抑制cdc25C蛋白的表达。因此，洛克米兰醇抑制肝脏细胞G2/M周期阻滞的机制是洛克米兰醇可通过下调cdc25C的表达进而抑制cdc2的去磷酸化，进而降低cdc2/cyclin B1复合物活性，最终诱导HepG2细胞发生G2/M周期阻滞。 MAPK信号通路在调控细胞增殖方面具有重要作用。有研究表明ERK、JNK和p38 MAPK信号通路都能通过不同的途径对G2/M细胞周期进行调控。ERK还可以直接参与cdc25C的激活过程，对G2/M期检测点进行调控[24]；JNK可以参与介导G2/M期相关蛋白cdc25C的磷酸化[25]；p38 MAPK 综上所述，洛克米兰醇可显著抑制HepG2细胞增殖，其在抑制肝癌细胞增殖的效果和对正常肝细胞的选择性方面优于阿霉素。洛克米兰醇主要通过引起HepG2细胞G2/M周期阻滞起到抗肝癌细胞增殖的效果。其作用机制可能为洛克米兰醇过度激活ERK信号转导通路，作用于cdc25C磷酸酶而使其失活，导致其无法激活cdc2而使cdc2/cyclinB1复合物活性降低，从而引起HepG2细胞G2/M周期阻滞。对于洛克米兰醇在体内抗肝癌的活性和机制还需进一步研究。 参考文献（略） 来 源： 王 辉，杨 蕾，孔令义．洛克米兰醇对肝癌HepG2细胞的抗增殖作用及其机制研究 [J]. 中草药, 2020, 51(16):4208-4216.
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