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摘 要：目的 对桂枝茯苓胶囊内容物正丁醇萃取部位进行化学成分研究和活性筛选。方法 采用多种色谱方法进行分离纯化，应用波谱数据解析鉴定化合物结构；对分离得到化合物进行原代小鼠子宫平滑肌细胞的钙离子内流作用的活性筛选。结果 从桂枝茯苓胶囊内容物正丁醇层分离得到5个没食子酰苷类化合物，分别鉴定为3′-O-没食子酰蔗糖苷（1）、4′-O-没食子酰蔗糖苷（2）、6′-O-没食子酰蔗糖苷（3）、1′-O-没食子酰蔗糖苷（4）、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖（5）。结论 化合物1～5为首次从该复方中分离得到，其中化合物1为新化合物；化合物1～5均有抑制原代小鼠子宫平滑肌细胞的钙离子内流作用。 桂枝茯苓胶囊是东汉张仲景的经典名方桂枝茯苓丸的现代剂型，全方由桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍、桃仁5味中药组成，具有化瘀、消癥、活血等功效。临床上主要用于治疗子宫肌瘤、盆腔炎、痛经、子宫内膜异位症、卵巢囊肿、乳腺增生等妇科疾病[1]。为进一步完善、提升桂枝茯苓胶囊标准化水平，解决制剂标准化关键问题，本研究对桂枝茯苓胶囊中特征性药效组分，采用现代中药化学方法对其中化学成分进行分离纯化、结构鉴定，探索其中功效成分，对构建桂枝茯苓胶囊基于功效成分的标准体系提供技术支持。在前期研究的基础上[2-6]，本实验对桂枝茯苓胶囊再次进行了化学成分研究。从其内容物正丁醇萃取部位分离得到5个化合物，分别鉴定为3′-O-没食子酰蔗糖苷（3′-O-galloyl-sucrose，1）、4′-O-没食子酰蔗糖苷（4′-O- galloylsucrose，2）、6′-O-没食子酰蔗糖苷（6′-O- galloylsucrose，3）、1′-O-没食子酰蔗糖苷（1′-O- galloylsucrose，4）、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-pentagalloylglucose，5）。化合物1～5为首次从该复方中分离得到，其中化合物1为新化合物。化合物1～5均有抑制原代小鼠子宫平滑肌细胞的钙离子内流作用。 1 仪器与材料 Bruker-AV-400型核磁共振光谱仪（Bruker公司）；Agilent 1260制备型高效液相色谱仪（Agilent公司）；SW-CJ-2F型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Thermoscientific 3100二氧化碳培养箱（Thermo公司）；CKX41SF倒置显微镜（Olypus公司）；96孔细胞培养板、25 cm2细胞培养瓶（美国Costar公司）；移液枪（Eppendorf公司）； BXM-30R立式压力蒸气灭菌锅，（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；LD4-2A离心机（北京众益中和生物技术有限公司）；invitrogen c1028细胞自动计数仪（ThermoFisher公司），Flexstation®3钙流工作站（MD）。 Sephadex LH-20凝胶柱（Pharmacia公司）；柱色谱及薄层硅胶（青岛海洋化工厂）；Fuji C18（250 mm×50 mm，5 μm）；色谱纯乙腈（OCEANPAK）；分析纯试剂（南京化学试剂有限公司）；DMEM/F12培养基（Gibco公司，批号1133032）；胎牛血清（Hyclone公司，批号SH30084.03）；胰蛋白酶（Amresco公司，批号1776226）；EDTA（AMRESCO公司，批号E0322）；青霉素/链霉素混合液（Biotopped公司，批号150525）；前列腺素F2α（PGF2α，Sigma公司，批号029K3784V）；Calcium 6-QF Assay Kit（MD）。 7周龄以上雌性ICR小鼠购于扬州大学比较医学中心，动物质量合格证号201603273。 桂枝茯苓胶囊（批号130201）由江苏康缘药业股份有限公司提供。 2 提取与分离 桂枝茯苓胶囊内容物（15.0 kg），以95%乙醇回流提取4次，每次2 h，提取液经减压浓缩至浸膏，制成水混悬液后依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁醇萃取，各4次，合并萃取液后蒸干备用。取正丁醇取部位浸膏（500 g），经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得7个馏份Fr. B1～B7。将Fr. B7经SephadexLH-20柱色谱，以甲醇洗脱，经制备型HPLC分离，以2%乙腈水反复纯化后，得到化合物1（5 mg）、2（5 mg）、3（5 mg）、4（5 mg）。将Fr. B6经SephadexLH-20柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，经甲醇重结晶，得到化合物5（80 mg）。 3 结构鉴定 [M－H]−（计算值493.119 9），分子式为C19H26O15。1H-NMR δ 7.16 (2H, s, H-2″,6″) 结合13C-NMR δ 167.6 (C = O),146.5 (C-3″, 5″), 140.0 (C-4″), 121.2 (C-1″), 110.5 (C-2″, 6″)，推测该化合物含有1个没食子酰基。1H-NMR观察到1个糖的端基质子信号δ 5.42 (1H, d, J = 3.4 Hz, H-1)，13C-NMR中除5个没食子酰基的碳信号外显示有12个糖上的连氧碳信号，其中δ 93.5 (C-1), 104.9 (C-2′) 为2个糖的端基碳信号，提示该化合物可能为二糖苷。采用5%硫酸水解，经薄层色谱鉴定为没食子酸、葡萄糖和果糖。通过HSQC、HMBC、1H-1H COSY和TOCSY将没食子酸、葡萄糖和果糖3个片段进行归属，在HSBC谱（图1）中观察到葡萄糖端基质子δ 5.42 (1H, d, J = 3.4 Hz,H-1) 与果糖2位δ 104.9 (C-2) 碳信号远程相关，表明该化合物含有1个蔗糖片段，蔗糖H-3′位质子信号δ 5.53 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-3′) 与没食子酰基δ 167.6 (C = O) 相关，所以确定化合物1为3′-O-没食子酰蔗糖苷。核磁数据归属见表1。 化合物2：白色粉末，ESI-MS m/z: 493 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.45 (1H, d, J = 3.8 Hz, H-1), 3.92 (1H, ddd, J = 9.9, 4.4, 2.3 Hz, H-2),3.74(1H, m, H-3), 3.39 (1H, dd, J = 9.8,9.1 Hz, H-4), 3.46 (1H, dd, J = 9.8,3.8 Hz, H-5), 3.87 (1H, m, H-6a), 3.16 (1H, m, H-6b), 3.67 (2H, m, H-1′), 4.49(1H, d, J = 7.2 Hz, H-3′), 5.37 (1H,t, J = 6.9 Hz, H-4′), 4.02 (1H, td, J = 6.9, 3.5 Hz, H-5′), 3.79 (2H, m,H-6′), 7.08 (2H, s, H-2″, 6″)。13C-NMR数据见表1。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定化合物2为4′-O-没食子酰蔗糖苷。 化合物3：白色粉末，ESI-MS m/z: 493 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.42 (1H, d, J = 3.8Hz, H-1), 3.38 (1H, m, H-2), 3.71 (1H, m, H-3), 3.36 (1H, m, H-4), 3.87 (1H, m,H-5), 3.75 (1H, dd, J = 12.4, 5.3 Hz,H-6a), 3.86 (1H, m, H-6b), 3.63 (2H, m, H-1′), 4.14 (1H, m, H-3′), 4.14 (1H, m,H-4′), 4.02 (1H, td, J = 8.0, 3.1 Hz,H-5′), 4.51 (2H, J = 11.8, 5.2 Hz,H-6′), 7.10 (2H, s, H-2″, 6″)。13C-NMR数据见表1。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定化合物3为6′-O-没食子酰蔗糖苷。 化合物4：白色粉末，ESI-MS m/z: 493[M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.46 (1H, d, J = 3.8Hz, H-1), 3.44 (1H, dd, J = 9.8, 3.8Hz, H-2), 3.71 (1H, m, H-3), 3.39 (1H, m, H-4), 3.86 (1H, m, H-5), 3.72 (1H, m,H-6a), 3.81 (1H, m, H-6b), 4.31 (1H, d, J = 12.0 Hz, H-1′a), 4.48 (1H, d, J = 12.0 Hz, H-1′b), 4.19 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-3′), 4.08 (1H, m, H-4′), 化合物5：白色粉末，ESI-MS m/z: 939 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.24 (1H, d, J = 8.3Hz, Glc-H-1′), 5.58 (1H, t, J = 8.3Hz, Glc-H-2′), 5.90 (1H, t, J = 9.7Hz, Glc-H-3′), 5.62 (1H, t, J = 9.7Hz, Glc-H-4′), 4.52 (1H, d, J = 10.3Hz, Glc-H-5′), 4.40 (2H, m, Glc-H-6′), 6.90 (2H, s, Galloyl-H-1), 6.95 (2H, s,Galloyl-H-2), 6.98 (2H, s, Galloyl-H-3), 7.05 (2H, s, Galloyl-H-4), 7.11 (2H,s, Galloyl-H-5)；13CNMR (100 MHz, CD3OD) δ93.9 (Glc-C-1′), 72.3 (Glc-C-2′), 74.2 (Glc-C-3′), 69.9 (Glc-C-4′), 74.5(Glc-C-5′), 63.2 (Glc-C-6′), 167.3～168.0 (5×C = O), 121.1～119.8 (5×C-1), 110.7～110.4 (5×C-2, 6), 146.6～146.3 (5×C-3, 5), 140.8～140.1 (5×C-4)。以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定化合物5为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖。 4 钙离子检测 用DMSO溶解，化合物1～5配制成质量浓度为12.5 mg/L的母液。 按照文献方法[9]，剥离多余部分，分离干净子宫组织，剪碎，消化酶消化细胞，终止后完全培养基重悬，接种到细胞培养瓶，隔2 d，PBS清洗2遍，弃去死细胞和杂质，加入完全培养基，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱继续培养。细胞培养至5～7 d传代，以低密度接种，进行免疫荧光鉴定，确定子宫平滑肌细胞的阳性率，用于后续试验。 原代小鼠子宫平滑肌细胞传代，以1×108个/L密度种板于黑色96孔板，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养过夜。弃上清，加入100 μL Calcium 6-QF溶液，37 ℃孵育2 h。分为空白组、模型组和给药组。空白组和模型组加入50 μL的PBS，给药组加入PBS稀释好的药液50 μL，作用15 min。Flexstation®3钙流工作站检测动态钙离子变化。仪器设置成运行20 s后，空白组加入50 μL PBS，其余各组加入PGF2α（终浓度为420 nmol/L）50 μL，测定100 s内钙离子的变化。 药物作用15 min后，直接上机检测钙离子的荧光强度，稳定20 s后，仪器直接加入相应液体，空白组20 s后的曲线因体积变化，荧光值有所增加。模型组和药物组20 s后曲线因体积变化先升高，又因加入PGF2α，曲线降低。药物组预给药后，曲线回升要高一些。图2结果显示，与空白组比较，模型组差异有显著性；与模型组比较，化合物1～5（12.5 g/L）组差异有显著性，能明显抑制USMCs内钙离子的内流（P＜0.01）。 5 讨论 原发性痛经是由于子宫平滑肌细胞受到刺激收缩后，促使子宫收缩，导致子宫缺血或血管痉挛而造成，而子宫平滑肌的收缩是通过细胞内钙离子的浓度来调节的[9]的。本实验从平滑肌收缩角度考察桂枝茯苓胶囊中分离得到的5个没食子酰苷类对原代小鼠子宫平滑肌细胞的钙离子变化影响，以期对其治疗原发性痛经等机制能有进一步的阐述。 没食子酰苷类成分是桂枝茯苓胶囊中主要成分之一，主要来源于方中的白芍与牡丹皮2味药材。本研究中的5个没食子酰苷类成分均有抑制原代小鼠子宫平滑肌细胞的钙离子内流作用，可能与其通过抑制平滑肌细胞内钙离子内流这一方式，影响子宫收缩，改善子宫痉挛及痉挛引起的局部缺血状态，最终发挥缓解治疗原发性痛经作用。提示桂枝茯苓胶囊中没食子酰苷类成分对于药物发挥治疗原发性痛经的功效具有一定的贡献，可作为桂枝茯苓胶囊治疗痛经的物质基础之一，在激素抑制、血管收缩抑制、细胞抗氧化[10]等角度进一步深入研究。 参考文献（略） 来 源： 张宏达，谢 雪，刘莉娜，倪付勇，殷红梅，王永香，张晨峰，王振中，肖 伟．桂枝茯苓胶囊化学成分研究（VII） [J]. 中草药, 2020, 51(16):4113-4116.
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