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Q：如何保证在eccDNA结果中线粒体是去除的？线粒体DNA占genomic DNA的比率大概是多少？ A: eccDNA中的线粒体是无法完全去除的，只能降低其在产物中的比率。 首先在eccDNA试验过程中，利用不同的核酸内切酶可以对线粒体进行消化。再者，将eccDNA下机数据在比对到参考基因组后，可以得到比对到线粒体的比率。一般而言，eccDNA测序数据在线粒体上的比对率小于10%。 Q：对于不同物种的eccDNA试验设计而言，测序深度是否有差异？测序深度和基因组大小有没有关系？ A：不同物种，测序深度是有差异的，在一定的测序量下，物种基因组越大，覆盖的深度越低。根据Devitt., et al. [1]一文中对eccDNA数据饱和度的估计，如下图所示，在50M的数据量下eccDNA鉴定数目趋于饱和，现嘉因对人和小鼠的eccDNA样本一般会测24G的数据量（约80M reads），能够满足后续的分析需求。 [1] Devitt, Mller Henrik , et al. "Near-Random Distribution of Chromosome-Derived Circular DNA in the Condensed Genome of Pigeons and the Larger, More Repeat-Rich Human Genome." Genome Biology and Evolution 1(2019):1.  Q：eccDNA能否和ATAC-seq和ChIP-seq联合分析，如果能，可以得到什么样的结果？ A：利用基于Tn5酶处理的ATAC-seq数据可以鉴定正常和癌症细胞系中的eccDNA，具体细节详见嘉因生物公共号中关于Kumar P., et al [2]一文的解读（什么？ATAC-seq数据居然能鉴定eccDNA?）。eccDNA与ATACseq 的联合分析能够得到开放染色质区域的eccDNA，而位于eccDNA上的基因与肿瘤细胞对于环境的适应性相关（如下图1），参考文章详见Wu S., et al.[3]。同样，利用ChIPseq与eccDNA进行联合分析，可以对位于eccDNA上的基因的转录机制进行解析，在胶质母细胞瘤样本中作者发现EGFR基因会从染色体脱落产生eccDNA，结合ChIPseq测序数据，作者发现EGFR增强子元件在9种胶质母细胞瘤种得到了持续扩增（如下图2），文章详见 Morton Andrew R., et al.[4] [2] Kumar P , Kiran S , Saha S , et al. ATAC-seq identifies thousands of extrachromosomal circular DNA in cancer and cell lines[J]. ence Advances, 2020, 6(20):eaba2489. [3] Wu, Sihan , et al. "Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression." Nature 575.7784(2019):1-5. [4] Morton Andrew R, Faber Zachary J et al. “Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications.”Cell, 2019, 179: 1330-1341.e13. 
Q：eccDNA的注释特点是什么？通常来说在哪个功能区域的eccDNA占比较高？ A：Teressa., et al.[5] 发现eccDNA 来自于基因组中的热点区域，包括：5′UTRs, exons 和 CpG islands。Kumar, et al [6] 报道称，eccDNA在内含子，基因，重复元件区域存在较多，结果见下图。 [5] Teressa, Paulsen , et al. "Small extrachromosomal circular DNAs, microDNA, produce short regulatory RNAs that suppress gene expression independent of canonical promoters." Nucleic Acids Research 9(2019):9. [6] Kumar, Pankaj , et al. "Normal and Cancerous Tissues Release Extrachromosomal Circular DNA (eccDNA) into the Circulation." Molecular Cancer Research Mcr (2017):1197.  Q：鉴定eccDNA的软件除了circleMap以外，还有没有其它的软件？ A：除circleMap外，CircleFinder, AmpliconArchitect也是大家常用的软件。 Q：如何保证数据分析到的是eccDNA而不是染色体DNA序列？ A： 在eccDNA建库测序前，试验人员已利用内切酶和外切酶对线性染色体上的DNA进行去除，关于试验流程，嘉因之前的帖子里有详细的介绍（这是一份详细的eccDNA富集protocol）。 Q：植物样本的可以做eccDNA吗？植物基因组比较小就几百Mb，测序数据量有何建议？ A：植物样本可以进行eccDNA的相关试验，不过在线粒体和线性染色体去除步骤要找到合适的内切酶及marker基因，目前在人和小鼠上marker基因比较明确，其它物种需老师提供marker基因，或者按照人和小鼠的反应条件直接进行试验。关于测序量的问题，参考问题2。 Q：关于生物学重复有何建议？临床样本不低于多少样本？ A：在临床样本中，目前调研到的生物学重复最低是6个，来源于文章Møller, H.D., et al.[7]。目前不同癌症类型的细胞系中鉴定eccDNA主要关注不同癌症类型，同一癌症类型的试验设计较少。 [7] Møller, H.D., Mohiyuddin, M., Prada-Luengo, I. et al. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue. Nat Commun 9, 1069 (2018). https:///10.1038/s41467-018-03369-8 Q：eccDNA能否分析突变？ A：eccDNA对于端点处的判定逻辑与结构变异，无论是在生物学机制的产生，还是相关软件的鉴定条件均有一定程度的相似性，是可以进行这方面的研究的。 Q：能否分析eccDNA来源的RNA？ A：发表于2019年Nucleic Acids Research 杂志的Teressa P., et al.[8] 文章中给出了答案。作者通过验证人工合成的环状DNA功能后发现，环状DNA能够产生短的调控RNA（microRNA/ si-like RNA），在没有典型启动子的情况下抑制基因的表达。来源于外显子的microDNA能够通过短的发夹结构抑制目标基因的表达；microRNA能够通过与RNA聚合酶相关，抑制基因表达。 [8]Teressa P , Yoshiyuki S , Pankaj K , et al. Small extrachromosomal circular DNAs, microDNA, produce short regulatory RNAs that suppress gene expression independent of canonical promoters[J]. Nucleic Acids Research, 2019(9):9. [9]Wu S , Turner K M , Nguyen N , et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression[J]. Nature, 2019, 575(7784):1-5. 
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