【原】ESR1基因突变与乳腺癌内分泌治疗耐药的相关性

杨雅岚，王佳玉，曾益新

中国医学科学院肿瘤医院

　　乳腺癌是目前全世界最常见的女性恶性肿瘤。ER在乳腺癌的内分泌治疗占有中心地位，但内分泌治疗过程中获得性耐药逐渐成为突出的问题。近年来，研究者利用二代测序技术检测出了数量可观的ESR1基因突变，并对这些突变基因的功能进行了初步探索，提出ESR1基因突变对乳腺癌进展及内分泌治疗耐药的产生可能发挥重要作用；同时，新的基因突变检测平台也在不断开发。这些研究成果为解决乳腺癌内分泌治疗耐药问题提供了新的思路，并为构建耐药基因突变监测系统提供了可能。

通信作者：曾益新（[e-mail]）

　　　　　王佳玉（[e-mail]）

原文参见：中华乳腺病杂志. 2017;11(2):166-170.

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　　乳腺癌是目前全世界最常见的女性恶性肿瘤。全球每年诊断的乳腺癌新发病例甚至超过了130万例【1】。其中，ER阳性乳腺癌约占75%，并且，ER与雌激素结合后，可以促进乳腺肿瘤细胞生长、增殖和存活；针对雌激素受体（ER）进行的药物治疗称为内分泌治疗，是乳腺癌治疗的基础【2】。在20世纪，所有确诊为ER阳性的乳腺癌患者均需接受内分泌治疗，近50%的患者对初始治疗反应良好，大大降低了乳腺癌的复发率及病死率【3】。内分泌治疗可通过降低雌激素水平或阻断ER功能的方式抑制乳腺癌生长。用药主要分为2类：一类通过减少雌激素合成起作用，即芳香酶抑制剂（AI），如甾体类AI（依西美坦）和非甾体类AI（来曲唑、阿那曲唑）；另一类通过阻断雌激素与肿瘤细胞上ER、孕激素受体（PR）相互作用（他莫昔芬、氟维司群），从而抑制肿瘤的增殖活性【4-5】。但是，即使初始内分泌治疗有效的患者，日后仍会因治疗过程中产生获得性耐药而出现疾病进展【3,6】。目前，关于耐药机制已有多种理论提出，如ER数量的上调、共调节因子的失衡或ER与某些酪氨酸激酶受体及其他激酶通路存在交互刺激等【6-9】。笔者主要综述编码ER的基因ESR1的异常与耐药的相关性。

　　1　ESR1基因的改变及其功能

　　ESR1基因是编码ER的基因。ESR1异常通常包括基因的扩增、重排及突变等几种形式。目前扩增和重排尚无明确证据支持与耐药相关，研究主要集中在ESR1错义突变方面【10-11】。随着二代测序技术的应用日渐广泛，越来越多类型的ESR1基因突变被检测出。K303R（A908G）突变由Fuqua等【12】在2000年发现，该突变可能通过激活IGF-1R/IRS-1/Akt通路，或与辅助激活/抑制因子结合情况的改变而使ER活性增强，从而显示出对内分泌治疗耐药【12-17】。有学者提出应用IGF-1R/IRS-1/Akt通路抑制剂克服耐药的设想，但仍需进一步研究证实【18】。另一类引人注目的ESR1基因突变被称为热点突变，因高频突变位点集中于ESR1编码ER的配体结合区域（LBD）的537～538位点而得名【19-21】。

　　ER的LBD对ER与配体的结合、ER促增殖功能的发挥等具有重要作用【21】。Zhang等【22】在1997年发现了ESR1LBD的Y537N突变，当时猜测该突变可能导致ER产生与配体结合后相似的构象改变而使ER激活，对肿瘤进展和耐药产生有促进作用。近年来，许多应用二代测序方法检测ESR1LBD突变的研究先后对此类突变的位点、频率、功能及其与耐药的相关性进行了探索，其中较重要的几项研究有：Toy等【23】对MSKCC及BOLERO-2研究中部分样本的分析，Robinson等【24】的MI-ONCOSEQ研究，以及Li【25】、Jeselsohn【26】和Merenbakh-Lamin等【27】的研究。综合上述研究数据，在经过至少一线内分泌治疗的转移性乳腺癌患者中，ESR1LBD的阳性率约占20%（39/187）【28】。各研究中ESR1LBD阳性率的差异较大（14%～54%）【28-29】，原因可能与研究样本量较小、纳入人群的差异、治疗情况的不同等因素有关。检出率最高的几个突变点依次为D538G、Y537S、Y537N、Y537C，其他检出的突变点还有L536Q、L536R、P535H、V534E，以及与hotspot相距较远的S463P、E380Q等；在同一标本中检测出2个ESR1基因突变的情况亦存在【28-29】。研究所取的转移性乳腺癌标本来自淋巴结、肝、骨、肺、脑等多个部位，ESR1基因突变并未表现出明显组织器官亲和力的差异【28-29】。此外，对这些ESR1基因突变患者内分泌治疗前的标本进行检测发现，除BOLERO-2研究的183例患者中有6例ESR1基因突变外，其他均无ESR1基因突变，提示ESR1的自然突变率明显低于内分泌治疗后【23-29】。

　　上述研究对各ESR1LBD突变的功能进行评估后，证实Y537、D538位点突变型ER的活性最高，且表现为非配体依赖的固有活性：雌激素缺乏条件下，野生型ER活性弱，但突变型ER仍显示出ER反应元件依赖的转录及靶基因表达，活性约为野生型的30～60倍；添加雌二醇后，野生型ER的活性提升5倍左右，但突变型ER的活性变化不明显【23-29】。这种活性被认为可能与突变型ER构象改变有关。通过构建分子动态模型发现，Y537S突变型ER中形成了S537-D351氢键（X线晶体结构造型已证实此氢键存在【30】），可以使ER较稳定地维持类似于配体结合后的激活构象从而发挥生物学活性。D538G突变型ER中也可形成G538-D351氢键，稳定性较S537-D351略差【23】。

　　除非配体依赖的活性外，Fuqua等【31】在2016年第39届圣安东尼奥乳腺癌研讨会上报道，ESR1基因突变可能还有促进肿瘤远处转移的作用。其研究团队用人源异种移植（PDX）模型证明：Y537S突变型乳腺肿瘤中上皮-间质转化（EMT）增加，而EMT被认为与肿瘤转移相关；Y537S突变细胞占肿瘤细胞的百分比与肺转移的频率相关；他莫昔芬虽不能抑制突变细胞的生长，但可有效降低远处转移的发生率。

　　2　ESR1LBD突变与耐药的关系

　　AI主要通过降低体内雌激素水平，减少其与ER的结合而达到抑制肿瘤生长的目的，但hotspot突变型ER具有非配体依赖的活性，可解释有此类突变的患者对AI的耐药现象【23-29】。关于ESR1LBD突变对他莫昔芬和氟维司群是否耐药，学者们亦进行了研究，结果表明，常规剂量的4-羟基他莫昔芬（4-OHT，为他莫昔芬的活性形式）或氟维司群仅能部分抑制突变型ER的活性，但进一步上调剂量后，仍可达到与野生型相同的抑制水平【23-29】。Jeselsohn等【26】也证实在不同氟维司群剂量组，突变型ER下调的幅度都较野生型小，提示突变型ER对氟维司群部分耐药。第3代选择性ER调节剂（SERM）苯卓昔芬对突变型ER的作用效果与4-OHT相似【23】。据此可推测：对ESR1LBD突变患者，AI耐药后换用他莫昔芬或氟维司群仍可能获益；常规他莫昔芬或氟维司群治疗耐药后，可考虑增大药物剂量；新型SERM或选择性ER下调剂（SERD）对ESR1LBD突变患者是否有优于他莫昔芬或氟维司群的疗效仍需进一步研究【28-29】。

　　目前认为ESR1基因突变相关的耐药主要为获得性耐药，因上述研究表明内分泌治疗后ESR1基因突变的检出率显著高于治疗前，机制可能是：内分泌治疗过程中，ESR1基因突变作为具有生存优势的基因被选择，携带ESR1基因突变的细胞从而存活下来，逐渐成为肿瘤中占主导地位的细胞株【23-29】。Jeselsohn等【26】在平均接受过多线治疗的亚组患者中观察到更高的ESR1基因突变频率，提示此类突变的频率与内分泌治疗时间相关，支持上述基因选择理论。因此，为ER阳性乳腺癌患者构建合理的筛查及监测系统，可使ESR1基因突变尽早被检测出，以便及时采取更好的治疗方案。另一方面，ESR1基因突变是否可作为判断预后的参考指标，仍需进一步行大样本的回顾性和前瞻研究证实【28】。

　　3　检测基因突变的新方法

　　目前应用的主流二代测序法包括454焦磷酸测序、Solexa测序及SOLiD测序等。在检测基因突变方面，其准确率主要受限于读长、碱基判定算法、突变种类及标本细胞量等【32】。为进一步提高检测的敏感度和特异度，学者们致力于开发新的测序平台。在二代测序基础上改良的有Safe-SeqS测序系统和双链测序法，可排除测序过程中DNA损伤的因素，将错误率降至1/109个核苷酸以下【33-34】；还有液滴数字PCR（ddPCR），DNA乳化后百万个微滴中各包裹一个DNA分子，再用引物扩增，较传统PCR方法提高了通量和准确性【35-36】。

　　除二代测序外，不少无需PCR扩增即可进行单分子测序的三代测序平台也处于研究阶段，如真单分子测序（SMS）、单分子实时测序（SMRT）、荧光共振能量转换（FRET）和纳米孔技术等，但此类平台目前尚未投入广泛应用【37】。

　　既往学界曾认为用于检测基因突变最理想的材料是肿瘤的活组织检查（活检）标本，但对多次疾病复发和进展的患者，反复进行组织活检可操作性低【28】。液态活检方法，包括游离循环DNA（cfDNA）和循环肿瘤细胞（CTC）的检测，提供了解决这一问题可行的途径【38-39】。已有研究者将肿瘤组织活检和cfDNA标本的ESR1基因突变检出率进行了对比，分别用二代测序和数字PCR（dPCR，含ddPCR）平台进行检测，结果显示：除ddPCR外的dPCR方法检测cfDNA较二代测序检测活检标本阳性率略低（66%～97%）；而通过ddPCR方法检测cfDNA的阳性率则高于二代测序检测活检标本【35-36,40-42】。近年来，BOLERO-2【43】、FERGI【44】、SoFEA【45】和PALOMA3【46】这几项引人注目的临床研究，也通过cfDNA方法检测出了较高频率的ESR1基因突变。因此，液态活检等新取材和ddPCR等新检测平台的组合有望促进更合理的ESR1基因突变监测系统的建立，有利于大规模回顾性和前瞻临床研究的开展。

　　4　克服ESR1基因突变相关耐药问题的新策略

　　综合上述ESR1基因突变产生耐药的机制及近年药物治疗的进展，克服乳腺癌内分泌治疗耐药问题可考虑从以下几个方面着手：（1）AI耐药的患者可更换为他莫昔芬或氟维司群治疗。NCCTGT研究证实，AI治疗耐药的ER阳性绝经后乳腺癌患者对氟维司群治疗反应良好【47】；SoFEA研究亦显示，含氟维司群的治疗方案对ESR1基因突变者的疗效优于依西美坦【45】。但常规剂量氟维司群可能对ESR1基因突变者疗效欠佳。（2）增加他莫昔芬或氟维司群的剂量。CONFIRM研究表明，氟维司群500mg剂量组患者在不增加不良反应的情况下较250mg推荐剂量组的无进展生存率提高了20%【48】。目前尚缺乏比较他莫昔芬治疗乳腺癌推荐剂量组与大剂量组疗效的研究，并且，需充分衡量大剂量他莫昔芬的获益及其部分激动作用相关的不良反应。（3）应用更强效的SERM或SERD。近年开发的新一代SERD有GDC-810、RAD1901、AZD9496等，此类新药均为口服，剂型方面优于肌肉注射给药的氟维司群，并且，临床前研究证实，AZD9496对ESR1基因突变型肿瘤的抑制效果与氟维司群基本相当；GDC-810正处于1期/2a期临床试验阶段，研究纳入30例ESR1LBD突变的乳腺癌患者，疗效如何有待研究结果揭晓【49-53】。（4）抑制共调节因子的活性。突变型ER的活性部分依赖于辅助激活因子如类固醇受体辅助活化因子3的募集，因此，ESR1共调节因子结合抑制剂可能取得一定的疗效。（5）阻断ER发挥作用的下游途径。如选择性CDK4/6抑制剂，通过阻断细胞周期的方式抑制肿瘤增殖。PALOMA3研究结果证实，在氟维司群基础上加用帕泊昔布对ESR1基因突变的疗效优于单用氟维司群，其他CDK4/6抑制剂如利泊昔布、阿本昔布亦值得尝试【45】。（6）阻断与ESR1基因突变有交互刺激的其他生长因子受体通路。如IGF-1R/IRS-1/Akt通路抑制剂可阻断ER与IGF-1R通路之间的交互刺激，K303R突变型细胞因此恢复对AI的敏感性【12-17】。（7）靶向ESR1基因突变本身。以ESR1基因突变自身作为免疫治疗的新靶点，还停留在设想阶段，其可行性尚需进一步的研究探索。（8）联合用药。Ladd等【54】尝试将小分子抑制剂JQ1或组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他（vorinostat）与氟维司群联用，可使肿瘤分别缩小41%和22%，但单药治疗效果不佳；帕泊昔布和依维莫司也只有在与氟维司群联用的情况下才可达到长期抑制肿瘤生长的效果。

　　除对治疗方案的修改及药物种类的更换外，新治疗策略疗效的评估也至关重要。目前PDX模型是可行的临床前疗效评估手段【25】。借助此类模型，某些药物如mTOR、PI3K和热休克蛋白90抑制剂单用或联合氟维司群的临床前疗效评估已经实现【55】。

　　5　结语

　　乳腺癌内分泌治疗中获得性耐药可能与编码ER的基因ESR1发生变异有关。目前研究较多的是ESR1LBD区域的Y537和D538等高频突变，称为热点区域【23-29,43-46】。突变型ER具有非配体依赖的固有活性，可解释ESR1LBD突变肿瘤对AI的耐药。同时，此突变对常规剂量他莫昔芬和氟维司群部分耐药，但通过增加药物剂量可逆转这种耐药【23-29】。对ESR1基因突变的监测应当从明确诊断乳腺癌开始，贯穿整个内分泌治疗过程，从而进一步揭示ESR1基因突变产生的时机、与预后的关系，以便优化临床决策。目前正在发展的改良二代测序、三代测序技术以及液态活检技术，均可为构建新的监测系统提供支持。

　　根据上述研究成果，可提出治疗ESR1基因突变的新策略，包括优化现有药物方案，如对AI耐药的患者改用他莫昔芬、氟维司群、新一代SERM/SERD，或增加他莫昔芬和氟维司群的用量等；以及应用某些选择性小分子抑制剂、通路抑制剂使ER下游转录途径阻断或活性降低等。这些新的治疗策略的临床前疗效评估可通过PDX模型或与其相似的模型进行，若疗效确切，可进一步开展相应的临床试验，以便为解决乳腺癌内分泌治疗耐药问题提供新的方法。

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