【原】CRISPR专利纠纷新进展，张锋或立于不败之地

作者：解螺旋.叶子

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导语

CRISPR以其前所未有的DNA编辑能力，让人们发现了基因改造的新天地。人们都看出了它巨大的价值，因此，关于这项技术的专利所有权，长期存在纠纷。

激烈的专利纷争

有市场分析认为，几年之内以CRISPR为基础的基因组编辑市场会达到每年数十亿美元的市场规模。而更乐观的估计则认为，这是一个年销售额接近500亿美元的庞大市场。面对CRISPR/Cas9这项具有巨大潜在经济利益的技术，谁拥有了它的知识产权，谁就有可能最大化市场收益。

之前专利竞争的两方分别是，加州大学伯克利分校的生物学家詹妮弗·杜德纳，以及麻省理工学院博德研究所的张锋。CRISPR/Cas9技术最早的发现者詹妮弗·杜德纳在2012年6月份向美国专利与商标局提交了正式的专利申请。而张锋所在的博德研究所在2012年底，张锋实验室证明CRISPR/Cas9技术能够应用于人类细胞基因组编辑的时候，才正式提交。

 

但博德研究所的专利律师成功地走了条快速审查的绿色通道，缴纳费用让专利局先审查自己的专利。所以在2016年1月11日，美国专利与商标局宣布启动抵触审查程序（Interference proceeding），重新审核CRISPR/Cas9技术的专利。根据2012年的美国专利法谁先发明谁能获得专利的排队规则（“first-to-invent”），双方必须提供充足的证据，证明自己一方率先发明了这项技术。

 

近日，博德研究所想出了一个新招，在目前有争议的13项CRISPR专利中，申请剥离出4项已获授权的专利。如果专利官员同意这个申请的话，使本来赢者通吃的情况发生了改变，双方有了和解的可能。除了这两者以外，以通用CAR-T疗法著名的Cellectis公司，也宣布拥有一项“利用嵌合限制性内切酶使基因失活”的专利，这项专利覆盖了利用核酸酶进行的大多数基因编辑程序，其中就包括CRISPR。

CNS上互不相让

无论关于CRISPR的争论有多少，这一技术对生命科学的贡献无可厚非。两位“创始人”，张锋和詹妮弗·杜德纳近日也分别在Science和Nature上发表了CRISPR的相关文章。

 

张锋发表在《Science》上的文章“High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome”，证实了CRISPR的技术能够识别控制疾病相关基因的调控元件。研究人员利用一个大型sgRNA文库鉴定出了影响基因调节的非编码元件。这些基因的功能缺失突变与癌症药物维罗非尼（用于治疗BRAF V600E突变的转移性黑色素瘤）的耐药性有关；因此，调控这些基因的启动子和增强子元件很受关注。

 

研究人员在每个携带BRAT基因突变的人黑色素瘤细胞中转入一个sgRNA，然后分别在对照组和维罗非尼组培养基中培养细胞。利用深度测序寻找药物组细胞中富集的CRISPR 突变基因位点，结果他们找到了上百个突变位点，大多数集中在靶标基因的5’末端，这些突变会降低基因表达，此外研究人员还发现CUL3周围25个位点中有24个会导致基因转录减少，和维罗非尼耐药性。

 

目前他们正在开发改善CRISPR/Cas9基因组筛选能力的方法，希望能够处理更长的基因组，从100万碱基延伸至32亿碱基。

 

詹妮弗·杜德纳也在《Nature》上发表了“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”的研究发现了靶向RNA的CRISPR系统中C2c2蛋白更广泛的用途。

研究者指出，C2c2能够作为一种RNA引导的RNA切割酶，具有两种不同的RNA切割活性，而不是像先前研究中描述的只有1种。第一种就是产生导向RNAs来促进C2c2寻找特殊的靶向RNA分子，第二种就是会激活一种互补的RNA靶点，从而作为一种常规的RNA切割器来破坏所有存在的RNAs。

crRNA和C2c2产生及工作机制

 

研究者利用C2c2精准地靶向和删除特定的RNA序列，降低相应蛋白的表达水平。CRISPR/C2c2系统仅靶向RNA的这种能力提供了高通量特异性操纵RNA的新方法，也补充了CRISPR的基因编辑功能。这种有着如此高活性的C2c2无疑为RNA检测提供了一条可能比PCR等更高效、高灵敏度的途径，这将在对痕量RNA的检测上显得尤其重要。

临床最新进展

在临床上，CRISPR正在成为人类对抗疑难杂症的利器。在《Sci Transl Med》上有个研究“Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells”，是美国加州大学伯克利分校与旧金山分校以及犹他大学组成的研究团队，利用CRISPR-Cas9技术在体外成功修复干细胞中的致病突变基因，给镰状细胞贫血症患提供了潜在的治疗方法。

正常红细胞（左）；镰状细胞（右）

 

镰状细胞贫血症的发病原因在于，血红蛋白基因上的一个碱基「T」被「A」取代，使血红蛋白的第六个氨基酸，谷氨酸被缬氨酸所代替，导致正常的血红蛋白HbA变成有害的血红蛋白HbS，使红细胞扭曲成了镰刀状。解决这个问题的思路非常直接，重写骨髓的造血干细胞中发生突变的基因序列，将致病突变基因修复掉。干细胞具有自我复制能力，这样一来，从理论上讲，镰状细胞贫血症患者可以摆脱该疾病的困扰。

 

将使用CRISPR-Cas9“改造”过的干细胞移植到小鼠体内后，研究组发现，这些干细胞可以存活至少16个星期，同时没有产生副作用的迹象。研究者认为需要在投入临床试验前解决的问题之一是效率。目前，该研究的效率仍待提高。当研究人员从患者身上提取造血干细胞，改造后在体外进行实验时，有缺陷的基因的修复效率是25%。但当研究人员将同样改造过的细胞移植到小鼠体内时，只有5%修复好的细胞能产生完好的血红蛋白。

 

而在《Cell Reports》上“A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia”这项研究通过CRISPR技术发现了大量治疗AML的靶点。研究人员改良过的CRISPR-Cas9能够有效地逐一破坏白血病细胞的所有基因。他们通过这种方式筛选癌细胞的薄弱点，寻找那些影响AML生长和生存的基因。

 
利用CRISPR/Cas9技术鉴定出AML白血病细胞的弱点

 

研究显示，近五百个人类基因是白血病细胞不可或缺的，其中两百多个基因可以成为治疗靶标。尽管在这些基因中，有一小部分基因，包括DOT1L、BCL2和MEN1已被确定为治疗靶标，但是它们当中的大多数是新的基因，这就为开发有效地抵抗这种疾病的疗法提供很多可能。

破坏转基因白血病模型小鼠体内AML细胞中KAT2A基因

 

研究人员选择对KAT2A基因进行深入研究。他们发现，抑制KAT2A的确可以影响AML细胞的生长和生存。在转基因小鼠的白细胞中破坏KAT2A基因可以抑制AML的发展。当KAT2A基因被破坏时，小鼠的存活期更长。