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作者：子非鱼（转载请注明：解螺旋·医生科研助手） CRISPR-Cas9 的基因组编辑技术给整个学术界和工业界带来革命性的变化，有数以千计的实验室在用该技术进行生物科学研究，然而关于该系统的五个基础性问题却依然是个谜团，引人深思。 尽管科学家Francisco Mojica不是第一个看到CRISPR现象的，但却是发现CRISPR系统的领军人物。1992年，当他首次观察到这个能引起生物技术革命的微生物免疫系统时，他重新检查了嗜盐微生物Haloferax mediterranei的基因组序列数据并注意到了14个近乎完美的回文结构——重复着30个碱基序列，并由36个碱基间隔开。然而他的研究发现在当时并没有引起学术界的重视，他们认为这种重复序列在多年前就已经在多种生物体中发现，但是其生物功能至今都没有解释清楚，所以不愿意耗费太多精力。 但是随着科研的进展，现在研究者已明白这些短规则间隔序列（SSR）可作为微生物的免疫系统能消灭侵袭病毒，并将其命名为CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats）。尽管目前绝大数生物研究者利用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑，但是Mojica和其他研究者依然被该系统的一些基础生物学问题所困扰，比如它是如何演变的，以及如何促进微生物进化的？为何有些微生物拥有该系统，而其他微生物却没有？也许CRISPR系统在微生物中还发挥着其他未为人知的生物功能。最早将CRISPR/Cas系统作为基因编辑工具的分子生物学家Jennifer Doudna也认为这些有趣的基础生物学研究仍需要进一步探索。 CRISPR技术起源自哪里？ CRISPR系统的生物学优势非常明显。原核生物（细菌等）以及生活在极端环境中的不知名单细胞生物（如古细菌）非常容易面临着入侵者外源核酸的持续攻击。病毒的数量以10：1的比例远超过原核生物，且据说每两天病毒就可以杀死世界上一半的细菌。原核生物还可通过质粒来交换DNA片段，一旦交换的DNA 能“绑架”宿主菌中生长过程的关键分子来维持自身稳定时，则该质粒具有会使宿主菌致病的能力。 然而原核生物也进化出了一系列应对外源基因侵袭的“生化武器”。比如，限制性内切酶就是一种能在/靠近DNA特定序列位点进行切割的蛋白酶。但是这种防御功能非常迟钝，因为每种内切酶只能靶向特定的基因序列。而动态的CRISPR/Cas系统却更加灵活，因为它会采取类似感染时抗体发挥长期免疫作用的具体机制，来对入侵的外源性核酸进行免疫应答和免疫记忆。 Mojica等研究者在观察到了CRISPR系统中的回文重复序列有时能与病毒基因组序列相匹配后，便对CRISPR/Cas的功能进行了深一步的研究。研究发现当细菌和古细菌暴露于特定的病毒或质粒时，某些特定的Cas蛋白可以一些间隔序列添加至基因组中。而后由这些间隔序列转录的RNA会引导其他Cas蛋白靶向任何能匹配间隔序列的外源性DNA/RNA并对其进行切割。 至于细菌和古细菌为何会拥用如此复杂的免疫系统，至今还没有得到解答。但是目前主流理论认为CRISPR系统来自于“跳跃的基因”——转座子（Transposon），可以从基因组的一个位置转移到另一个位置。美国国家卫生研究院的进化生物学家Eugene Koonin和他的同事发现了一类可编码蛋白Cas1的移动基因，Cas1能将间隔序列插入基因组中。他们认为这些“Casposons”可能就是CRISPR-Cas免疫系统的起源。目前研究者正在对这些DNA转座子的转移过程及追踪机制进行深入研究，并希望以此来揭示CRISPR/Cas系统的复杂性。 CRISPR/Cas系统的免疫功能 近年来已有很多研究对Cas蛋白如何在基因组中添加间隔序列（Spacers）的分子机制进行细致的阐明。但是病毒DNA的化学成分与宿主DNA几乎完全一致，那么在含有外源病毒DNA的细菌中，Cas蛋白是如何确定需要被CRISPR系统识别切割的外源DNA呢？维尔纽斯大学的生物化学家Virginijus Siksnys认为，这些酶是把双刃剑，存在错切的风险；如果细菌将间隔序列添加至自身DNA中，那么就会收到自身免疫系统的自杀性攻击。 北卡罗来纳州立大学的微生物学家Rodolphe Barrangou认为，这可能是因为细菌和古细菌庞大的种群数量可以容纳这些错误的发生，因为如果种群中的大部分个体能在病毒的攻击下得以生存的话，那么牺牲一部分细胞也并不会种群数量造成影响。 实际上，当病毒入侵到某种细菌群体后，通常1000万个细菌中只有一个能获得正确的间隔序列从而获得相应的病毒防御功能。洛克菲勒大学的微生物学家Luciano Marraffini认为，由于很难捕获真正获取得具有免疫功能的细菌个体，使得细菌获取间隔序列的机制研究变得非常困难。 然而，已有研究报告认为含有CRISPR/Cas系统的细菌细胞可作为一种记录装置，对其所遇到的DNA和RNA序列进行分类记录。这便允许研究人员实时监测细菌细胞随着环境中化学物质的变化，其基因表达水平的变化；这对揭示间隔序列的识别方式以及提高它们与基因组融合的速度是非常有用的。 另外，研究者也对CRISPR/Cas免疫记忆的形成进行了深入研究。绝大多数拥有CRISPR/Cas系统的微生物都只含有几十个间隔序列，有的只有一个间隔序列。然而不同的是，古细菌Sulfolobus tokodaii有1%的基因组对应着其5种CRISPR/Cas系统，并包含了485个间隔序列。 通常，细菌并不会保留一些被废弃的间隔序列：如果病毒变异后能从CRISPR/Cas免疫系统逃逸，那么之前针对该病毒的间隔序列就会被废弃，进而变成为细菌中冗余的DNA片段。威茨曼科学研究所的遗传学家Rotem Sorek认为细菌不可能会使其基因组永久的处于扩张状态。 CRISPR系统的其他功能 目前，已知CRISPR系统中有不超过3%的间隔序列在现有的已知的DNA数据库均找不到相应的匹配序列。这也反映出我们对病毒知之甚少，因为大多数测序工作主要集中在感染的人类、牲畜和农作物。佐治亚大学的RNA生物学家Michael Terns就认为目前我们对细菌的敌人，尤其是古生菌的敌人，所掌握的知识还非常浅薄。 至于这些不匹配任何序列的间隔序列，研究者认为可能是CRISPR/Cas系统行使除了防御病毒侵染外其他生物功能的关键所在。这些序列在一些细菌中可进行DNA修复，基因表达和生物膜的形成；同时它们还可确定细菌感染他人的能力，比如引起军团病（一种大叶性肺炎）的嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）就只能在Cas2蛋白存在时，感染宿主变形虫。麻州大学医学院的分子生物学家Erik Sontheimer认为，CRISPR的其他功能还有待挖掘，也许这是与RNAi相平行的系统，因为RNAi在早期也主要被认为一种防御机制，随后也证实了RNAi具有调节宿主基因表达的作用。 为何不是所有微生物都拥有CRISPR系统？ 尽管CRISPR/Cas系统还具有其他生物学功能，显然一些特殊的微生物体内存在着相比于其他微生物更大量的CRISPR/Cas序列和蛋白。目前，超过90%的古细菌拥有CRISPR免疫系统，而只有1/3已测序的细菌存在该系统。古细菌Nanoarchaeum equitans寄身在另一种沸水古生菌中，其遗失了很多与细胞能量产生基因和管家基因。然而在其本身极微小的DNA（490000-letter）中，N.equitans却拥有一个约30个间隔序列的CRISPR/Cas系统。分子生物学家Malcolm White认为，该古生菌的将大量基因组序列应用于CRISPR系统，这也说明了CRISPR系统非常重要，也许是病毒防御或其他作用，但是目前我们对其原因还并不知晓。 微生物学家Edze Westra认为对于生活在适宜环境中的细菌而言，这种系统出现的频率也不同。举个例子，鸟类病原体Mycoplasma gallisepticum在其感染宿主由鸡类转为野生雀鸟时，其CRISPR/Cas系统将被抛弃。一些数学模型和早期实验表明，在处理少数几种病毒时，CRISPR系统更具有优势。因为该系统可记录有限数量的病毒基因序列来避免所添加的DNA序列成为冗余的基因序列。但一旦环境中病毒的多样性大大超过了CRISPR系统承受能力，其作用效果将会大大降低。 而另一种可能就是在极端环境中生存的古细菌不可能依赖于其他方法进行病毒防御。细菌阻止病毒侵袭最常见的一种方法就是对外壳蛋白进行突变，而古细菌却不太可能采取此方法，因为在极端恶劣的生存环境中，外壳蛋白对古生菌的生存显得至关重要。这也使得CRISPR系统在古生菌中变的更加活跃。 CRISPR/Cas系统的种类分型 因CRISPR/Cas9在基因编辑的简单性和灵活性，人们往往对其投入了极大的关注和研究力度。但是微生物对该系统并不偏爱。相反，它们倾向于将几个不同的CRISPR/Cas系统混合起来，并从其他细菌中迅速获取新的CRISPR/Cas系统及很快淘汰原有的系统。 研究人员已经正式确认了6种不同类型的CRISPR系统，有19种亚型。而Marraffini认为我们仅仅知道其中一小部分的生物功能。然而解开这些系统背后的具体机制是能够发现CRISPR/Cas系统新的生物功能的关键。举例来说，CRISPR/Cas9是一种II型系统，可采用间隔区序列转录的RNA分子对入侵的病毒或质粒DNA直接进行酶切。但是去年从VI系统发现的Cas酶可以切割RNA而非DNA。其中，IV型系统含有一些CRISPR/Cas相关的基因，但缺乏重复序列和间隔序列。 III型系统在自然界中是最常见也最难理解的CRISPR/Cas系统。迄今为止的证据表明，它们并不针对入侵的DNA或RNA本身产生应答反应，而是对DNA转录成RNA的过程产生干扰。如果这是事实的话，这将产生一个新的技术，扩大了CRISPR/Cas基因组编辑的形式。 参考文献：Five big mysteries about CRISPR’s origins |
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