【原】4把芭蕉扇，助过“火焰山”

解螺旋 2020-08-27

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作者：子非鱼（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

做科研一如去西天取经，需历经九九八十一难才能取得真经（文章、基金等）。显然，WB对科研苦行僧而言，绝对是一座座山路崎岖却又不得不翻越的大山，尤其是WB定量简直堪称火焰山，让不少研究者望而却步。所以，欲过此山，这四把能帮你一灭WB定量的嚣张气焰的芭蕉扇你必得随身携带。只有如此，在翻过此山之后，你才会发觉WB定量其实没有想象中那么难。

过火焰山之四大芭蕉扇

1.寻找图片的线性范围

作为一个称职的且非常会拍照的科研狗，首先要先确保你的“照相机”（WB条带检测器）会以足够敏感的方式去捕获WB条带最美的一面，以便后续检测蛋白含量变化，而这个敏感性就即所谓的“线性范围”。

如果你的探测器已达到饱和的检测极限，且再也不能吸收光子，那么很有可能本该让你惊鸿一瞥的美景就这么与你擦肩而过（数据被丢失了），自然而然，你与高分顶尖文章也只能是失之交臂。

幸运的是，现阶段很多图形捕获系统配有软件，旨在检测饱和度，并自动纠正曝光，从而确保WB数据分析是可以被定量的。因而，花费一定的时间检测相关软件的是否能正确运行是很有必要的。

另外，为了防止膜上的饱和，你必须凭经验确定你的线性范围，即将一系列连续稀释已知量的蛋白裂解液进行WB的预实验，并将其条带的定量密度与所上样的量进行相关联，即可得到一个线性方程，如此便可为后续目的蛋白定量提供一条标准曲线。而且也可通过上样时减少总蛋白含量，以及尝试新的抗体或减少胶片曝光长度对标准曲线进行优化。

2.减去背景

在WB的世界中曾流传过这么一句话——最让人心塞的是，不是雾霾天你拍不清我的脸，而是明明天气和条带一样的美丽，却被你拍出了霾的效果。谁能告诉我，以下图片背景拍成这样，到底是什么鬼？！

显然，这些模糊一团的WB图片会因相貌过于丑陋，不仅会被喜以外貌定一切的审稿者而拒之门外，而且也将实验结果的分析造成不小的影响。

若起因源于图片捕捉检测器，需对仪器所携带的拍摄软件进行熟练化练习，以便后续拍摄图片时能凸显自己所感兴趣的条带，并弱化背景。若这是因为一抗浓度高或洗膜时间和次数不够造成的，则需要我们注意操作规范，在降低一抗浓度的同时不要偷工减料，洗膜要按照Protocol上做。

3.WB定量的校正者——内参君

正所谓，没有对比就没有伤害。你自以为棒棒哒的目的条带，就真的是无人可比的么？大错特错！此时，只需要看看别人家的孩子（内参君），自家条带是好是坏就立见分晓。而这位内参君到底有什么与众不同之处，可作为衡量自家条带的“标杆”呢？说到底，是因为其性格沉稳，且不易受外界因素影响（胞内表达相对恒定）。

通常，这些内参君来自于胞内的“持家基因”的产物，例如肌动蛋白，β-微管蛋白或类似Hsp70的伴侣蛋白，不仅可校正实验误差，而且可保证实验结果的准确性。（点击“搞定内参君，驾驭Western blot已成功一半”，教你轻松选择合适的内参君）

另外，以下四个步骤可作为WB条带的校正标准：1、确定目的蛋白质（PI）和标准化对照（NC）的背景扣除密度。2、识别具有最高密度值的NC。3、将所有NC值除以最高的NC密度值，得到相对的NC值。如果你这样做正确的最高密度值将是1，其他的一部分（例如，0.97）。4、将所有PI值除以相应通道中的相对NC值。

4.WB重复性实验

通常对于定量实验，应对每一个实验条件进行一式三次地WB（优选在相同的印迹膜上）。当每个重复实验确定出了每个孔的校正值，即可得出其平均值、p值。而后需在三个独立时间内进行整个实验，以确保实验结果的重复性，而并非是一种偶然。

参考文献：The 4 Important Steps for Western Blot Quantification

你造么？WB定量软件除了imageJ，还有它！

说起WB条带的半定量，Quantity ONE&Image J无疑撑起了半天（这里请点击“干货 | 量化WB条带，就靠Quantity ONE&Image J！”来认真学习软件教程）。在此，本文将给大家安利一种WB精确定量的神器——美国LI-COR公司的Odyssey双红外激光成像系统。

而之所以说Odyssey系统会成为照亮蛋白质研究的阿拉丁神灯，是因为该系统可在利用红外荧光染料标记的二抗孵育完后，可直接进行扫描成像，其重复性和定量准确性远优于现阶段WB成像的常用方法——ECL化学发光法，即依赖与二抗标记的辣根过氧化酶HRP催化底物发光，而其信号可被CCD成像系统进行记录。

Odyssey系统检测原理示意图

举个栗子，Odyssey系统检测的荧光信号强度和结合的二抗数量具有线性关系，保证定量的准确性；但在ECL法中，酶催化反应的制约条件很多（如温度、酶活性、pH值、曝光时间等），常会导致即使是同一个样品、同一张膜，其先后取得的图片其差异性很大。

另外，Odyssey系统可直接检测实验结果，且具有极宽的线性范围。因为在红外荧光区域，背景荧光信号将大大低于可见荧光区域，因而即便是WB中较弱的信号都可以清晰成像（灵敏度高），进而提高了实验重复性和定量精确性；但ECL酶促发光是一个非线性放大的过程，对低丰度蛋白会线性失真，对高丰度蛋白又会出现信号饱和，无论是动态范围，还是线性范围，都只能说差强人意。这一点，早于2007年被PNAS的一篇文章证实了。