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作者：Lucky King 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 Aurora A激酶调节卵巢癌细胞中的非同源末端连接和寡聚（ADP-核糖）聚合酶功能 回复170802可下载，一周有效 Aurora A激酶（AURKA）通过介导有丝分裂和染色体稳定性，在卵巢癌进展中起重要作用。 本文主要研究其机制。 对于看paper爱跳阅、爱看图的我，极度讨厌英语缩写 AURKA抑制PARPi敏感/抗性卵巢癌细胞的生长和克隆存活 为了了解AURKA抑制作用，采用了已建立的卵巢癌细胞系：PEO1、SKOV3ip2、PEO4、OVCA429、MDAH、A2780、OVCAR5和OVCAR10。首先用PARPi，rucaparib（卵巢癌药物，也是PARP抑制剂）处理这些细胞系，检测细胞系活力，以作为每个细胞系同源重组（HR）状态的指示。 结果（补充表1）显示：在测试的8个卵巢细胞系中，PEO1（BRCA2-突变，HR缺失细胞系）最敏感（IC50=0.324μmol/L）；PEO4和SKOV3ip2（没有BRCA1/2突变），耐Rucaparib；OVCA429（无BRCA1/2突变），对rucaparib表现出适度敏感性（IC50=5.5μmol/L）。原代正常人卵巢表面上皮细胞（HOSE）也用rucaparib治疗，表现出对PARPi的抗性。 接下来使用alisertib（Aurora A激酶抑制剂）对卵巢癌细胞（PEO1、OVCA429、PEO4、SKOV3ip2）处理7天，检测对其生长的影响，分别显示出高度敏感、中度敏感性和耐Rucaparib。同时使用alisertib处理HOSE细胞，以确定AURKA特异性小分子抑制剂对正常细胞的影响。Alisertib有效抑制PARPi-敏感和PARPi-抗性卵巢癌细胞的生长，但对正常HOSE细胞的生长影响很小（图1A和表1）。 类似地，纳摩尔浓度的alisertib处理PEO1、SKOV3ip2细胞后，细胞克隆存活数呈现出剂量依赖性方式的显著降低（图1B）。 抑制AURKA改变DDR（ DNA damage response损伤应答）蛋白的表达 为了确定抑制AURKA活性对卵巢癌细胞DDR的影响，首先分析alisertib处理PEO1（PARPi-敏感型细胞系）和PEO4、SKOV3ip2（PARPi-抗性细胞系）对HR和NHEJ信号通路分子表达的影响。 在细胞系PEO1、PEO4、SKOV3ip2中，以纳摩尔浓度的Alisertib进行处理，所有细胞系中PARP表达降低，且表示出剂量依赖性。Alisertib处理后降低了PEO1、PEO4、SKOV3ip2细胞中HR途径蛋白（BRCA1、BRCA2）的表达。（Fig.2A） 检测AURKA抑制对NHEJ（非同源末端连接）途径的潜在影响。DNA-PKcs中Thr2609位点的磷酸化是NHEJ修复DSB途径所必须的，对该磷酸化进行检测。Alisertib处理后，增加PEO1（PARPi-敏感）和SKOV3ip2、PEO4（PARPi-抗性）卵巢癌细胞中pDNA-PKcsT2609水平（Fig.2A）。 结果表明：持续抑制AURKA活性可诱导DNA损伤，减弱HR通路，刺激NHEJ途径。 为了进一步证实抑制AURK对NHEJ通路作用的特异性，使用靶向/非靶向（NT）两种siRNA转染PEO1、SKOV3ip2细胞（功能试验）。由于AURKA是卵巢癌细胞存活的必要条件，AURKA高度敲除对细胞致死，因此，作者选择使AURKA的表达降低。 结果显示：AURKA表达降低后，增加了PEO1、SKOV3ip2细胞中DNA-PKcs和H2AX的磷酸化（Fig.2B）。 这些研究结果表明：抑制AURKA，通过增加DNA-PKcs活性和降低HR蛋白BRCA1/2的表达来刺激NHEJ通路。AURKA受抑制也提高了pH2AX S139表达水平，诱导DNA DSB（DNA double-strand breaks DNA双链断裂）。 抑制AURKA活性会增加pH2AXS139 ，使NHEJ DNA修复容易出错 当DNA损伤时，组蛋白H2AX的S139位点会被磷酸化，并且会将DNA修复蛋白集中到细胞核内新生的DSB位点。为了检测抑制AURKA是否诱导DNA的DSB，检测alisertib处理对pH2AXS139 形成的影响。Alisertib处理PEO1、SKOV3ip2细胞后，显著诱导pH2AXS139 增加3.7倍、2.5倍（Fig.3A）。 接下来，检验AURKA活性受到抑制对NHEJ DNA修复的直接功能影响。先使用alisertib处理细胞，然后使用HindIII（限制性内切酶，能使双链DNA产生粘性末端）或I-SceI（限制性内切酶）消化Pem1-EGFP-Ad2质粒，产生粘性末端即DNA DSB（DNA损伤-双链断裂，即制造模型），从而进行NHEJ功能测定（Fig.3B）。 用62.5nmol/L alisertib抑制PEO1细胞（PARPi-敏感）中AURKA活性，使得HindIII和I-SceI线性化质粒的末端连接增加1.8倍和2.5倍（Fig.3C） Alisertib处理SKOV3ip2细胞(PARPi-抗性)的作用不太明显，但HindIII和I-SceI 底物的末端连接仍然分别显著增加了1.3倍和1.4倍（Fig.3C）。 这些数据表明：在PARPi敏感/抗性卵巢癌细胞中，抑制AURKA会诱导DNA DSBs（损伤）升高，使通过NHEJ途径修复DNA损伤更容易出错。 AURKA调节PARP活性 检测AURKA是否调节PARP活性，抑制AURKA活性对其影响。使AURKA在pADPr聚合物上表达。使用PARPi抑制PARP活性，降低卵巢癌细胞中pADPr水平。增加rucaparib浓度，处理PEO1细胞，观察到pADPr表达水平降低，并具有浓度依赖性（图4A）。 类似地，Alisertib抑制AURKA后也降低了PEO1、SKOV3ip2细胞中pADPr的表达，且具有剂量依赖性，表明PARP活性降低（图4B）。 进一步构建AURKA-RFP强制表达载体，相对于RFP转染的细胞（对照）导致pADPr表达升高，表明当AURKA过表达时，PEO1和SKOV3ip2细胞中PARP活性增加。尽管pADPr水平升高，但是PARP水平没有因为AURKA的过表达而发生改变。（图4D&E） 此外，AURKA过表达，pDNA-PKcsT2609和pH2AXS139水平没有改变，表明DNA DSB未被诱导，并且NHEJ通路没有受到刺激（图4D&E）。AURKA在PEO1、SKOV3ip2细胞中强制表达后，PARP表达水平不改变。 总之，结果表明：AURKA调节PARPi敏感/抗性卵巢癌细胞中PARP活性。 Alisertib处理刺激NHEJ途径，降低体内 PARP水平 在体外观察到AURKA调节DDR和DNA修复途径，作者想知道体内是否也能发生。检测原位异种移植的SKOV3ip2细胞中pAURKAT288、pDNA-PKcsT2609、Ku80和PARP水平。 将SKOV3ip2细胞注射入SCID小鼠，使肿瘤扩散四周，然后用质粒或低剂量alisertib处理小鼠，确保观察时不是由于偏离目标而影响结果。在最终施用alisertib（阿利西利肽）后6小时，将小鼠安乐死，并通过免疫组织化学（IHC）评估NHEJ途径中信号分子、PARP的表达。 检测pAURKAT288显示，Alisertib处理的肿瘤中AURKA活性降低。与对照相比，观察pDNA-PKcsT2609水平升高，在alisertib治疗的肿瘤中Ku80表达适度增加，表明刺激NHEJ途径。相反，与对照组相比，检测到alisertib治疗的肿瘤中PARP表达水平降低。（图5） 总而言之，这些观察结果表明：抑制AURKA活性，降低PARP表达，并在PARPi-抗性卵巢肿瘤细胞体内激活NHEJ DNA修复途径，与体外观察一致。 Alisertib刺激BRCAness和PARP抑制的协同作用 虽然PARP抑制剂被认为是卵巢癌的突破性治疗药物，但一般仅在BRCA突变体肿瘤中推荐使用。寻找可以增强“BRCAness”的临床靶点，就像使用AURKA抑制剂显示的那样，可能会有另一突破。（扯临床意义呢） 在TCGA中对超过400个卵巢癌肿瘤查询，使用cBioPortal（www.cbioportal.org），确定在同一肿瘤中经常观察到PARP1和AURKA的拷贝数变化（图6A），并且观察到具有共发生趋势（图6B）。两个mRNA的共表达没有显著相关（数据未显示）。数据分析：作者认为alisertib和rucaprarib的组合可能更具临床益处。 合成杀伤力是指同时改变两种基因或蛋白质引起细胞的死亡，而不是单独的基因/蛋白质的改变。观察到抑制AURKA，降低BRCA1/2蛋白水平导致BRCAness，假设alisertib和rucaparib(卵巢癌药物)具有协同作用。 使用图3所示的NHEJ功能测定法，用alisertib和rucaparib组合处理PEO1细胞。相对于单独用药，I-SceI-线性化质粒末端连接增加1.3倍。相对于对照，增加2.9倍（图6C）。当使用HindIII测定时，也观察到药物组合的修复增强，但不具有统计学意义。 接下来，使用alisertib和rucaparib组合处理BRCA-野生型（SKOV3IP）、BRCA-缺陷型（PEO1）细胞，如（图6D）所示：alisertib和rucaparib的联合治疗抑制细胞生长，并且在两种细胞系中均具有协同作用。 这些结果表明：Alisertib诱导引起的BRCAness表型（BRCA蛋白表达下降，诱导引起NHEJ途径修复DNA）可能有助于PARPi敏感肿瘤患者（无HR缺陷）。重点是，这种临床方法可以改善疗效并减少alisertib和PARPi的不利副作用，因为其药物组合使用较低剂量时活性更显著。
亮点总结
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