|
作者：子非鱼 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 SDS-PAGE作为一个老生常谈的实验，早已广为科研者所知。然而该实验虽然基础，但是细节繁琐，耗时长久，光是配制试剂就要花费2个小时左右。而这还只是Western blot（WB）的第一步，也使得完成WB实验将会耗费2天左右的时间。 这也难怪科研者们常说，一入WB深似海，从此休闲是路人。不过，实践出真知，长期在该实验里跌爬滚打的实验狗们也总结出了若干小技巧，可使大家轻松快捷的完成该实验。 1 未雨绸缪，做好万全准备 常言道，不打无准备之仗，方能立于不败之地。实验中种种试剂、抗体等等均是完成实验这座大厦的基石，如果基石打不牢，实验很有可能会半路夭折。而实验中最痛苦的莫过于与实验结果就差那么一步之遥。 以Western blot（WB）为例，这眼瞅着就要到条带现身的奇迹时刻，却愣是让曝光试剂的匮乏给硬生生的截断了见证过程，又怎会不让人懊恼上火呢？ 其实，上述窘境皆是科研者在实验前准备不足所致，若是能提前发现试剂的不足，或对试剂重新订购，又或者重新配制溶液，均能再次推进实验进程。然而就这订购或配制试剂的过程无疑会消耗我们的时间以及精力。 那么为了避免原材料浪费以及节省更多的时间，SDS-PAGE电泳过程中的一些试剂还是早早的配制并妥善保存起来为好，如此方可以备不时之需。 缓冲液（buffer）: 关于这一点，你可能早已知晓，但再次重复一遍也不是坏事。实验中可将所有的凝胶缓冲液进行一次性大量配制，如此可方便后续实验中对其的任意使用。至于配制的浓度，10x浓度是实验室配制母液常用的浓度。 有些实验室会多次重复利用这些凝胶电泳缓冲液，在这种情况下，建议每次使用buffer时均要在缓冲瓶上贴一个标签，已记录使用的次数，超过一定期限后就要对缓冲液进行重新配制，以免对实验结果造成影响。 过硫酸铵（APS）： 小编在接触SDS-PAGE电泳之初，每次配胶时均会制备新鲜的APS，可后来发现溶解后的APS在分装后，可在-20℃冰箱中得以长期储存。 另外，如果你需要经常使用SDS-PAGE凝胶，那么可取出一只分装后的APS溶液，将其置于4℃冰箱里，可保证其一个月不会过期。 凝胶（gel）： 凝胶是现用现配的好，已成为了各位实验狗心中的常识，那么是不是就意味着凝胶不能提前制备么？其实不然，提前准备好的凝胶在4℃冰箱中大致可以保持两周左右。 但需要谨记的是在储存凝胶时，保持凝胶湿润是非常重要。可以将凝胶板、梳子甚至整个固定装置都装入一个充满蒸馏水的塑料盒中，而后再将其放在4℃冰箱中进行保存。 在此，小编要向大家推荐一款试剂盒——Epizyme PAGE凝胶快速制备试剂盒，其中准备妥妥的预混配方，可以帮大家快速简单的配制分离胶和浓缩胶，即无需计算溶液量，也无需稀释，只需按等比例混合即可，因而可在很短时间内灌制多块凝胶，进行蛋白变性/非变性的电泳分析。 该试剂盒比较酷炫的一点就是，其配制的浓缩胶是彩色的，这就为区分点样孔提供了极大的帮助，从此加样再也不是一件需要费眼力的活儿了。此外，凝胶配制时无需添加TEMED（有恶臭气味的有毒试剂）即可凝固，各位小伙伴们再也不用担心实验中毒的问题了。 样品（sample）： 大家都知道，制备好的蛋白样品要放在-20℃冰箱中进行存储，有时一些稀少珍贵的样品甚至还要放在-80℃冰箱里保存。 在此，小编建议在储存近期就要进行PAGE电泳的蛋白样品时，可将该蛋白样品与loading buffer混合在一起，加热变性之后再进行储存。如此就可以在上样前，将蛋白样品解冻并离心即可。小编曾用该法储存样品长达一年的时间，且实验结果依然没有被破坏。 2 改变分离胶的覆盖液体 通常多数人在制备好分离胶后，会用蒸馏水覆盖其上，以避免分离胶的高低不平。但是实际上，此时用异丙醇代替水的效果会更好，因为异丙醇可以更好保护凝胶，并使凝胶更快地发生聚合，进而节省制胶的时间。 3 缓冲液不够用？准备些弹珠吧 有时，实验过程中，你会忽然发现没有足够的电泳缓冲液，此时一个节省时间的方法就是在现有电泳缓冲液添加一些弹珠（是的，就是我们小时候曾经玩过的），以提高缓冲液的高度水平来保证缓冲液能没过上样孔。 但是要确保这些弹珠是洁净的，否则一旦其对上样的蛋白样品造成了污染，就不要妄想此次实验会得到一张漂亮的实验结果图片了。 4 传输缓冲区 每个做SDS-PAGE电泳的童鞋，只怕都担心过内腔中的电泳缓冲液会有所泄露，毕竟当缓冲液水平降低过多，以至于不能达到覆盖加样孔时，就会导致孔内变得干燥，进而使得凝胶电泳变得无法正常运行。 也许，有人会建议你，当你发现缓冲液下降的太过厉害，则需要暂停电泳，打开电泳槽，重新给内腔添加电泳液，而后再次开启电泳过程。可能电泳期间你会多次重复该过程直至实验完成为止。 显然，该方法需要大家时刻关注电泳槽内腔类电泳液的高低水平变化，其实也是蛮费时费力的。而小编的做法则比较简单粗暴，即一次性在内腔外部也添加同水平的电泳液，如此便可以一劳永逸的解决内腔电泳液泄露问题。 参考文献：SDS-PAGE Tips and Tricks to Save You Time |
|
|
