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解螺旋公众号·陪伴你科研的第2218天 红白血病的前世今生，追溯到的他她它？你能懂？ 大家好，我是巧巧，今天给大家带来的一篇文献是"C/EBPa and GATA-2 Mutations Induce Bilineage Acute Erythroid Leukemia through Transformation of a Neomorphic Neutrophil-Erythroid Progenitor"，这是今年发表在Cancer Cell（IF:23.916）上的一篇文章。 根据题目提取要素，可以得出本文的主变量是C/EBPα与GATA-2基因突变，疾病是急性红细胞白血病，表型是中性粒细胞-红系祖细胞转化。 因而，可以提出的科学假设是在红白血病中，由于C/EBPa与GATA-2基因突变可导致中性粒细胞-单核细胞祖细胞(NMP)向中性粒细胞-红系祖细胞转化而致病。  研究背景 1. 急性髓系白血病（AML）主要是指包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病，通常是由体细胞突变而产生的，而本文中的红白血病属于FAB分型中的M6型，主要诊断标准为骨髓原始细胞（原粒细胞或原单核细胞，NEC）I+II型≥30%，红细胞系≥50%。 2. 染色质容许状态（permissive chromatin state）通常可以伴随着转录能力的增强，可以提高肿瘤细胞、干细胞等增殖活性。 研究结果 首先，作者论证双等位基因C/EBPa与GATA-2 ZnF1突变可在白血病中发挥协同作用。 作者首先构建小鼠模型，KLG 型小鼠指的是移植双等位基因C/EBPa与GATA-2 ZnF1突变细胞的小鼠，KL型小鼠指的是移植C/EBPa突变细胞的小鼠，G型指的是移植GATA-2突变细胞的小鼠，观察到KLG 型指小鼠在20周后表现出髓系细胞增多，且红细胞减少，白细胞增多，血小板减少，脾大的表现。(Fig 1A-D)检测KLG白血病小鼠的外周血与骨髓图片发现，KLG小鼠可同时存在髓样和红系原始细胞（标记为KLG-E小鼠），与仅仅显示髓样母细胞（标记为KLG-M小鼠）。(fig 1F-H)对比两者生存率发现，KLG-E小鼠的白血病进展更快。（fig 1I） 图1 Cebpa与Gata2 ZnF1突变可以协同导致红白血病 再次，作者进一步论证C/EBPa与GATA-2基因突变的中性粒细胞-单核细胞祖细胞(NMP)具有异常的红细胞系谱潜能。当对比WT鼠,G鼠,KL鼠,KLG-M鼠,KLG-E鼠之后，发现KLG-E小鼠中的cki+ Mac1lo未成熟髓系细胞比例升高，骨髓和脾脏中主要是原始红细胞（fig2）。 图2 KLG-E小鼠的脾脏与骨髓中可同时检测到原始红细胞与原始髓系细胞 另外，作者通过流式细胞术计数发现，KLG-E小鼠的骨髓中的造血干细胞（LSK cell）相对减少，但是造血干细胞（LK cell）显著升高，通过进一步标记表明KLG-E小鼠中造血干细胞主要是中性粒细胞-单核细胞祖细胞(NMP)。（fig 3A-C）因而，作者注射L-NMP细胞，L-EoMP细胞与L-EB三种白血病细胞进行造模发现，KLG-E鼠中的骨髓和脾脏中未成熟细胞L-NMP升高比例最明显，且骨髓中均含有未成熟髓系细胞。因而作者提出C/EBPa与GATA-2基因突变鼠中白血病的起始细胞（LIC）主要是中性粒细胞-单核细胞祖细胞(NMP)。(fig 3D-E)。 图3 Cebpa与 Gata2双基因突变可以维持NMP免疫表型的白血病起始细胞 将红白血病的起始细胞（LIC）进行测序，作者使用PCA分析正常白细胞，白血病前体细胞和白血病祖细胞，发现L-MB与L-EB细胞群更接近于NMP细胞群。（fig 4A）而GSEA分析也表明L-EBs红细胞分化特异性基因表达降低，髓系的基因升高，而L-MB相对前体细胞的中性粒细胞分化基因表达降低。(fig 4B)对比这几类细胞的转录因子谱发现，L-EB高表达 Cebpa, Cebpb,Fli1与Sfpi1 ，L-MB高表达C/EBPa, the C/EBPb,FLI-1, and PU.1，而L-EB红细胞发育相关的转录因子Gata1,Klf1与Zfpm1 (编码FOG-1）低表达。（fig 4D）另外根据单细胞 测序与tSNE结果也可看到基因突变的白血病小鼠可以高表达人白血病干细胞基因(fig 4E)。 图4 红白血病起始细胞具有异常髓系转录编程 作者论证C/EBPa与GATA-2基因突变的中性粒细胞-单核细胞祖细胞(NMP)是中性粒细胞-红细胞白血病是启动细胞。将KL鼠与WT鼠对比以及KLG鼠与G鼠对比，发现Cepba突变很可能导致骨髓系基因缺失和巨核-红细胞基因富集。（fig 5A-B）进一步通过测序结果显示双等位CEBPa基因突变存在的情况下，NMP中的红系TF(Gata1、Gata2、KLF1和Zfpm1)上调，髓系(CEBPA、CEBPB、FLI1和Sfpi1)和普遍表达的造血TF(IKZF1、Etw6和RUNX1)未见明显升高或改变。（fig5C-E）当微流控qPCR验证红细胞转录因子上调情况，发现WT与G鼠中红细胞转录因子表达低但是 Cebpa突变的NMP可以共表达髓系与红细胞的转录因子（fig 5F-G）。 图5 双等位基因Cebpa突变的NMP具有异常红细胞系编码 为了比对GATA2突变对白血病前体细胞的基因表达的影响，作者使用ATAC测序评估KL鼠,KLG-M与KLG-E鼠的NMP细胞，发现KLG-E鼠的NMP的峰值强度，TF基序染色质可及性与前两者均不同。（fig 6A-B）通过分析转录因子谱发现GATA2突变后NMP的红细胞转录因子基序提高，但是髓系转录因子基序降低，然而NMP同源TF编码基因的表达水平没有差异。（fig 6C-E） 图6 GATA-2 ZnF1突变可以诱导红细胞容许的细胞质状态（Erythroid-Permissive Chromatin State） 那么问题来了，当CEBPA和GATA2突变后，小鼠体内的白细胞数量会发生变化么？作者发现CEBPa突变增加了小鼠骨髓干细胞（LSK和LK群体），尤其是Gata1阳性的骨髓红系祖细胞，尤其是红细胞或巨核细胞系谱的细胞包括EMkMPPs,MegEs, MkPs, PreCFU-Es and CFU-Es。（fig A-E）而双基因突变的KLG鼠中EMkMPPs和CFU-ES细胞会选择性扩增，从而证明这两个突变基因在祖细胞层次结构上的协同效应，特别是在红系CFU-E祖细胞的生成中。(fig F) 图7 GATA-2 ZnF1突变可损害髓系干细胞向红系分化状态 最后要来个大满贯，作者再次进行细胞水平验证，探讨白血病前体细胞NMP与红白血病KLG鼠的L-NMP的双能性。 野生型小鼠的NMP主要向中性粒细胞和单核细胞分化，但是KLG鼠的NMP主要产生未成熟髓系和红系细胞的集落。（fig 8A-B）两者的基因分群也完全不同,野生型一般仅仅表达部分髓系转录因子，红系转录因子的表达频率显著降低，而KLG鼠可以同时表达髓系与红系的转录因子，并具有向中性粒细胞与红细胞分化潜能。（fig8C-D）最后，作者为了验证KLG 的L-NMP细胞具有向红细胞及中性粒细胞分化的潜能，使用EGFP标记的慢病毒感染KLG-E的L-NMP白血病细胞，并移植给为照射过的受体。 4周后检测EGFR+的L-NMP,L-EB与L-MB的基因信息，发现这三者具有显著的重叠。（fig 8F-I)尤其是EGFR+的标签细胞群体显著升高，说明L-NMP细胞在小鼠体内自我更新的同时，还会产生L-MB和L-EB母细胞。
图8 红白血病起始细胞在细胞水平具有双向分化潜能  小结 这篇文章的主要研究意义在于，通过协同转录和表观遗传重编程，发现白血病早期的祖细胞。也就是中性粒细胞-单核细胞祖细胞(NMP)中CEBPA和GATA2突变分别通过增加红系转录因子(TF)的表达和产生红细胞染色质开放状态，从而建立中性粒细胞-红系祖细胞成为红细胞白血病的启动细胞（leukemia-initiating cell，LIC）。 本文的比较大的难点在于，要分清检测结果中的转录因子的细胞类型，中性粒细胞，单核细胞及红细胞及前体细胞的标记和类型。当然，读懂这篇文章，你就会进一步了解M6红白血病的祖细胞来源与分化还有分型的依据，并充分体会到髓系白血病中基因突变与细胞异质性的魅力所在了！ 点下“在看”，多根头发 |
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