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在过去的几十年里，人们开发了许多用于蛋白质结构预测的计算工具，其中 Phyre2 因其强大的分析能力与简单的操作被生物科研人员广泛使用，据统计每天都有约 1000 个任务提交到 Phyre2 服务器上。 Phyre2 分析能力强大，结果界面丰富直观，可以预测和分析蛋白质的结构、功能和突变。 相比之前的版本 Phyre v 1.0，Phyre2 使用更先进的远程同源检测方法来构建蛋白质三维模型，预测配体结合位点，并分析氨基酸突变（如 SNPs）对目标蛋白序列的影响。 接下来让我们一起来感受下。 登录 Phyre2 主页，复制并粘贴目标氨基酸序列到框中。填写提醒邮箱。选择 Normal（普通）或 Intensive（强化）模式。提交任务后页面会显示任务进度和预测所需时间。  提交 Phyre2 任务 结果页面分为几个主要部分： 总结 序列分析 二级结构预测 结构域分析 模板的详细信息 在某些情况下结合位点预测和跨膜螺旋的预测。 1. 序列分析 序列分析 2. 二级结构（α-helix, β-strand 或 coil）的预测 模块的第一行显示了序列的位置。残基基于氨基酸性质进行着色：极性的氨基酸 A,S,T,G,P 为黄色，疏水性的氨基酸 M,I,L,V 为绿色，荷电性的氨基酸 K,R,E,N,D,H,Q 为红色，芳香性的氨基酸 W,Y,F,C 为紫色。 置信度线评估区域预测的可信度，红色表示高置信度，蓝色为低置信度。只有在序列数据库中检测到大量不同的序列同源序列时才能达到 78 - 80% 的准确度。一般不考虑置信度  二级结构类型的预测 3. 结构域分析 通过 Phyre2 与已知结构序列的匹配，上传序列和已知序列结构之间对齐，框的宽度表示比对上的长度，用颜色显示对同源性的置信度（红色表示高置信度，蓝色为低置信度）。 将鼠标悬停在它们上面，会弹出模型的图片和详细信息。单击此链接可转到详细结果表中对应的条目。能够看到上传序列是否有一些区域是无法建模，或者是否有多个模板覆盖上传序列的不同区域，指示上传序列可能的蛋白质结构域。  结构域分析 4. 详细模板信息表 显示使用的 PDB 模板及其代码，从 PDB 文件中提取关于蛋白质模板的信息、对模型的置信度和上传序列的覆盖率、3D 模型、置信度、百分比序列标识和文本描述。 如果对匹配的模型特别感兴趣，可以通过单击「Phyre Investigator」在弹出的页面中点击 submit 按钮提交。  模板信息 5. 使用 Phyre Investigator 深入分析 Phyre Investigator 界面由几个部分组成，点击「Analysis」部分中的「Quality」选项卡，可以看到包括 ProQ2(模型质量预测系统)、clashes、rotamers 和 Ramachandran 分析等在内的选项按钮。 点击这些按钮可以比较模型区域的质量。如果建模质量低的残基与您要研究的残基相距很远，或者处于在功能上不太重要的环（loop），则不需要考虑它们。 但是，如果质量低的残基位于功能位点附近，则应谨慎考虑，并研究其他可能避免这些问题的替代模型或方法。 单击 Analyses（分析）部分的 Function（函数）选项卡，可以显示保守区域、接触界面、口袋和突变敏感区等选项。保守区域可以为查找功能残基提供线索。如果高度保守的残基恰好存在于口袋中，这就能确切说明其功能是十分重要的。  使用 Phyre Investigator 查看模型质量  使用 Phyre Investigator 查看蛋白功能 随着光标在序列视图中移动，模型上的红色指示点以及右侧的序列谱（Sequence Profile）和突变倾向图（Mutations）也会随之移动或改变。 如果某些残基被预测为质量较低，但又可能具有重要的功能，可以在序列视图中悬停它，查看它们的突变情况和突变图示。 进而可以探究一下突变是否对某些类型的氨基酸有强烈的偏好，某些突变敏感度高的残基可能具有显著表型效应，而这些信息可以指导进一步的突变实验，帮助解释单核苷酸多态性（SNPs）的作用。 Phyre2 具有预测点突变表型效应的功能，但不能准确地确定点突变在超出侧链估计位置之外结构上的影响。  序列视图的使用 6. 模型叠加分析（Superposition） 在选择一个主模型之后，还可以勾选多个从模型来进行叠加。点击主表的底部 Generate superposition of selected models（生成所选模型的叠加）的按钮。 叠加使用 MaxSub 算法 m33 执行。该算法能够找出在 4.5A 范围内叠加的两个结构之间原子的最大子集。一般情况下，会选择得分最高的模型作为主模型，或者根据之前的一些生物学知识背景来判断值得研究的模型。 生成所选模型的叠加 点击表格下方的 Generate superposition of selected models（生成所选模型的叠加）的按钮，选中的模板将叠加在主模型上。 进入的页面中有一个 JSMol 窗口，用于交互查看叠加的模型，右侧有相应的一些描述和帮助信息。其中 RMSD（均方根偏差）显示了叠加构象与目标构象所有原子偏差的加和，其值越小，构象差异越小。 手动旋转叠加的模型，在三维空间中可以寻找模型的哪些区域是一致的。通常可以观察到一个保守内核（core）具有可变的表面环（surface loop），它可以表明哪里可能存在建模错误或具有结构灵活性。  交互查看叠加的模型 7. 结合位点预测 如果给得分最高的模型预测出的概率 >90%，则模型和序列会自动提交给 3DLigandSite 服务器进行配体结合位点预测。蛋白质通常作用于配体 (如酶底物) 上或受配体调控。3DLigandSite 将类似结构的配体叠加到目标蛋白的结构模型上，并将残基保存映射到蛋白质表面，结合两种方法产生的数据进行预测。 3DLigandSite 的结果分为四个主要部分。第一个提供了使用的 phyre 模型信息。第二部分显示了已识别的配体簇表。后两个部分显示 3DLigandSite 预测。表中列出了所有预测的结合位点残基，详细说明了它们所接触的配体数量、残基与残基保存分数 (JSD) 之间的平均距离。  结合位点预测 Jmol 对建模的蛋白质、配体集群和预测的结合位点进行了可视化。用户还可以对预测残基进行标记，以便研究预测的结合位点。  结合位点可视化 8. 跨膜螺旋的预测 Phyre2 通过支持向量机（一种机器学习工具）处理上传的序列和 PSI-Blast 检测到的同系序列，会确定上传序列是否包含跨膜螺旋，并预测它们在膜中的拓扑结构（平均准确率为 89%）。 如果预测跨膜螺旋，将显示每个跨膜螺旋的开始和结束以及膜的胞外和胞质侧示意图，并用数字表示残留指数。 此外，在结果页面顶部有一个包含基本信息及有效期的框。如果任务即将到期，文本变成红色，这时点击「续领 30 天」链接，可以重置结果的有效期。也可以将结果全部下载保存（点击 Download zip of all results）。  任务信息 Phyre2 主页： 图片来源：作者提供 |
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