【原】【微专题】血球计数板的构造和使用方法

囡波湾生物 2020-09-25

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【知识梳理】

1．血球计数板的构造

血球计数板用优质厚玻璃制成，每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。计数池两侧各有一个支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.1mm的计数池（下图）：

每个计数池内有一个方格网，其划分为9个大方格（如下图A所示），每个大方格的面积为1 mm²，加盖玻片后的深度为0.1 mm。因此，每个大方格的容积为0.1 mm³。另外，中央大方格（计数室）以双线等分为25个中方格（如下图B所示）。每个中方格又等分为16个小方格，供细胞计数用。

2．血球计数板的使用方法（以计数酵母菌为例）

（1）用血球计数板计数培养液中的酵母菌个数。

（2）样品稀释的目的是便于酵母菌的计数，以每小方格内含有4～5个酵母菌为宜，一般稀释10倍即可。

（3）将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室盖上专用的盖玻片。

（4）将稀释后的培养液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗人，多余的菌液用吸水纸吸取，稍待片刻使酵母菌全部沉到计数室内。

（5）计数时，如果使用16×25型的计数室，要按对角线位，取左上，左下，右上，右下4个中方格（即100个小方格）的酵母菌个数3如果为25×16型的计数室，除了取其4个对角方位外，还需再数屮央的一个中方格（即80个小方格）的酵母菌个数（如上图B所示）。

（6）当遇到位于方格线上的酵母菌，采用样方法中“计上不计下，计左不计右”的计数原则，如图4所示。

（7）对每个样品计数3次，取其平均值，再按有关公式计算每毫升培养液中所含的酵母菌个数。

3．血球计数板的计数公式

①在计数时，先统计（图B所示）5个中方格中的总菌数，求得每个中方格的平均值再乘以25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1 mL菌液中的总菌数。

②设5个中方格中总菌数为a，菌液稀释倍数为b，则0.1mm³菌液中的总菌数为（a/5）×25×b。已知1mL＝1cm³＝1000 mm³，1 mL菌液的总菌数＝（a/5）×25×10000×b＝50000a·b。

4．使用血球计数板的不足之处

用血球计数板观察一定容积中的细胞或微生物数量，然后推算出含菌数，简便快捷。但是在计数时,包括死活细胞或微生物及微小杂物均被计算在内，这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的细胞或微生物进行计数。当然，结合染色法排除死细胞等的影响可以减小实验的误差。

【例题领悟】

例1 下列关于“培养液中酵母菌种群数量的变化”实验的相关操作，正确的是（　　）

①培养酵母菌时，必须去除培养液中的溶解氧　②将适量干酵母放入装有一定浓度葡萄糖溶液的锥形瓶中，在适宜条件下培养　③将培养液振荡摇匀后，用吸管从锥形瓶中吸取一定量的培养液　④在血细胞计数板中央滴一滴培养液，盖上盖玻片，并用滤纸吸去边缘多余培养液　⑤将计数板放在载物台中央，待酵母菌沉降到计数室底部，在显微镜下观察、计数　⑥计数时，压在小方格界线上的酵母菌应计相邻两边及其顶角　⑦早期培养不需取样，培养后期每天取样一次

A．①②③④⑥ B．②③④⑥⑦

C．②③⑥ D．②③⑤⑥

解析 ①培养酵母菌时，不要去除培养液中的溶解氧 ④中不是先在血细胞计数板中央滴培养液，再盖上盖玻片，应该是盖上盖玻片之后再滴培养液 ⑦早期培养也要取样观察。

答案 D

例2 血细胞计数板（图中规格是25×16）是微生物计数的常用工具，盖玻片下的培养液厚度为0.1mm。如图所示是培养液稀释100倍后的镜检结果，如果中方格内的大肠杆菌数刚好是五点取样平均数，则1mL该培养液中大肠杆菌的数量约为（　　）

A．4×10⁹ B．4×10⁸

C．4×10⁷ D．4×10⁶

解析图中一个样方中大肠杆菌数为16个，因此整个计数板中大肠杆菌数=16×25=400个，1mL该培养液中大肠杆菌的数量约=400÷（1×1×0.1×10^-3）×100=4×10⁸个/mL。
答案 B

【练习突破】

1．在一定量的酵母菌培养液中放入活酵母菌若干，抽样镜检，视野下如图甲所示（图中小点代表酵母菌）。将容器放在适宜温度下恒温培养5小时后，稀释100倍，再抽样镜检，视野下如乙图所示。根据实验结果判断，以下叙述正确的是（）

A．培养5小时后，酵母菌种群密度增加200倍左右

B．探究酵母菌的种群数量变化可以用标志重捕法

C．用血细胞计数板计数酵母菌数量时只统计方格内菌体

D．培养5小时后，酵母菌种群数量已经达到K值

2．某研究性学习小组探究酵母菌种群在不同的培养液浓度和温度条件下种群密度的动态变化，进行了如下实验，实验操作步骤如下：

第一步：配制无菌马铃薯葡萄糖培养液和活化酵母菌液。

第二步：利用相同多套装置，按下表步骤操作。

装置编号		A	B	C	D
装置容器内的溶液	无菌马铃薯葡萄糖培养液/mL	10	10	5	5
	无菌水/mL	—	—	5	5
	活化酵母菌液/mL	0.1	0.1	0.1	0.1
温度（℃）		5	25	5	25

第三步：用血细胞计数板计数装置中起始酵母菌数目，做好记录。

第四步：将各装置放在其他条件相同且适宜的条件下培养。

第五步：连续7天，每天随机抽时间取样计数，做好记录。回答下列问题：

（1）改正实验操作步骤中的一处错误：________________________________________。

（2）某同学第5天在使用血细胞计数板计数时做法如下：

①振荡摇匀试管，取1mL培养液并适当稀释（稀释样液的无菌水中加入了几滴台盼蓝染液）。

②先将_____________放在计数室上，用吸管吸取稀释后的培养液滴于其边缘，让培养液自行渗入，多余培养液___________________，制作好临时装片。

③显微镜下观察计数：在观察计数时只记_____________（填“被”或“不被”）染成蓝色的酵母菌。

（3）如所使用的血细胞计数板有16个中方格，每1个中方格中有25个小方格，每1个大方格容积为0.1mm³（1mL=1000mm³）。请推导出1毫升培养液中酵母菌细胞的计算公式：酵母细胞个数／mL=______________________________________________________。

3．蓝藻、绿藻和硅藻是湖泊中常见藻类。某课题组研究了不同pH对3种藻类的生长及光合作用的影响，实验结果见图1、图2。请回答下列问题：

（1）根据图1和图2分析：3种藻类中pH适应范围最广的是____________；在pH=8.0时，3种藻类中利用C0₂能力最强的是____________。

（2）在培养液中需加入缓冲剂以稳定pH，其原因是__________________________。

（3）在实验中需每天定时对藻细胞进行取样计数，请回答以下问题：

①取出的样液中需立即加入固定液，其目的是______________________________。

②在计数前通常需要将样液稀释，这是因为______________________________。

③将样液稀释100倍，采用血细胞计数板（规格为1mm×lmm×0.1mm）计数，观察到的计数室中细胞分布见图3，则培养液中藻细胞的密度是_________________个/mL。

【解析与答案】

1．解析比较甲、乙两图中央两格酵母菌数，乙是甲的两倍，乙是稀释100倍后的镜检结果，故培养5小时后，酵母菌种群密度增加200倍左右。标志重捕法适用于活动能力强、体型较大的动物，酵母菌的种群数量计数不能用标志重捕法。用血细胞计数板计数酵母菌数量时应统计方格内和压在相邻两边上的菌体。培养5小时后，酵母菌种群数量并不能确定是否已经达到K值。

答案 A

2．解析（1）实验中要注意遵循单一变量和对照原则，该实验中要注意在每天同一时间取样，否则由于时间不同而影响结果的准确性。（2）计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400个小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm²，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm³。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。（3）计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格（即80个小方格）的酵母菌数。对每个样品计数三次，取其平均值，按下列公式计算每1毫升菌液中所含的酵母菌个数。 ①16格×25格的血细胞计数板计算公式：酵母细胞数/mL=（100个小格内酵母细胞个数/100）×400×10⁴×稀释倍数。 ②25格×16格的血细胞计数板计算公式：酵母细胞数/mL=（80小格内酵母细胞个数／80）×400×10⁴×稀释倍数。

答案（1）第五步中应每天同一时间（定时）取样（2）②盖玻片用滤纸（吸水纸）吸去 ③不被（3）平均每个小方格的酵母菌数×400×10⁴×稀释倍数

3．解析（1）比较图1和图2中的三条曲线，代表绿藻的曲线最平缓，变化幅度最小，说明pH对绿藻的生长和光合作用速的影响最小，绿藻对pH适应范围最广。比较图2的三条曲线，pH为8.0时，蓝藻的光合速率为4.0 umol．Mg^-1．min^-1，为三种藻类中最大，C0₂是光合作用的原料之一，因此其吸收利用C0₂的能力也就最强。（2）由于三种藻类呼吸作用过程中会产生C0₂，光合作用过程中需要吸收C0₂，而C0₂会导致培养液的pH改变，从而影响三种藻类的生长速率和光合速率，影响实验结果。因此，实验前需要在培养液中加入pH缓冲液以维持反应溶液的pH稳定。（3）①由于上述藻类繁殖周期短，在取样后到计数这段时间内有些个体很可能完成了增殖，从而影响计数结果，所以取样后应立即进行杀死固定。 ②利用血细胞计数板进行计数时，每个中格中的细胞数目不能太多，一般不超过5个，否则细胞可能有相互遮盖现象。如果发现细胞数目过多，应对培养液进行以1 0倍为单位的稀释。 ③从图3知道，血细胞计数板的计数室体积为1mm×lmm×0.1 mm=0.l（mm）³ =10⁴mL。每个计数室包括25个中格，每个中格包括16个小格。这种规格的计数板在计数时，除了取其4个对角处的中格（左上、右上、左下、右下）外，还需再取中央的一个中格，即80个小方格。如果使用计数室为16中格×25小格规格的计数板，计数时只要取4个对角处的中格（即100个小格）。当遇到位于中格线上的细胞，一般只计数中格的上方和左方线上以及左角处的细胞，也可以只计数中格的下方和右方线上以及右角处的细胞，只要满足两线夹一角就行了。对每个样品应计数三次，取其平均值。计数结果为：左上中格为5个（左线3+内部2），右上中格为4个（全部在内部），中央中格为3个（左线1+内部2），左下中格为4个（全在内部），右下中格为4个（上线2+内部2），共20个，平均每个中格为4个，则每个计数室为25×4 =100个。每毫升培养液中的细胞数为100÷10－4=1×l0⁶个。由于计数时培养液稀释了100倍，所以原培养液中藻细胞的密度应为100×l×l0⁶=1×10⁸个。本题在设计时考虑到了有人计数中格的下方和右方线上以及右角处的细胞这种情况，结果一样。