  （1）用对照灌注液灌注； （2）用BEx灌注液灌注； （3）将未灌流的对照品在室温下于颅内保持10 h PMI，复制第1组和第2组的总PMI; （4）冲洗1小时的PMI，表示在当前交通条件下最短的组织处理时间。在整个实验期间进行了全局电生理监测、超声检测、Micro-CT脑血管造影、磁共振成像、组织含水量检测、动物组织形态学检测（电镜）、胶质细胞炎症反应实验、脑组织切片电生理、整体脑代谢的测量。   a，灌注和未灌注猪脑的T1加权MRI扫描。在所有三个平面中，侧脑室（LV）的轮廓以绿色显示。箭头，由于气体积聚造成的掉落信号；插图，皮层下解剖标志和灰白色对比。 LCC和APD可作为脑肿胀和心室形态的代表。b，用于干湿质量分析的组织采样位置（红色）。 c，各实验组的组织含水量。  细胞结构完整性，神经元和caspase 3激活的分析。a，描述区域细胞结构完整性的海马尼氏染色。插图，将装有BEx灌注液的容器与对照灌注液条件进行比较。b，具有较高放大倍率场（右侧）的代表性视场（左）对应于CA1和齿状回的框状区域。比例尺，200μm（左），50μm（右）。c，d，CA1（c）和齿状回（d）中的神经元细胞密度。e，CA1中具有肿胀形态的细胞百分比。f，在CA1（左）和齿状回（右）中用DAPI复染（蓝色）对NeuN（绿色）或actCASP3（绿色）进行免疫荧光染色的共聚焦图像。对于actCASP3图像，右边的图像表示方框区域的放大。比例尺，50μm（NeuN / DAPI），50μm（actCASP3 / DAPI，左），10μm（actCASP3 / DAPI，右）。g，h，CA1和齿状回中actCASP3-阳性核的标准化百分比。 作者采用免疫组化、焦油紫染色等方式对神经元及髓鞘轴突活性的不同方面进行了检测。  灌注和未灌注脑中caspase 3激活的动力学。a，前额叶皮层中actCASP3（绿色）的免疫荧光染色的共聚焦最大强度投影。方框区域在下面放大。比例尺，50μm（顶部）; 10μm（底部）。图像来自每种情况的代表性大脑；每组n = 6个独立的大脑重复进行实验，结果相似。b，标准化的actCASP3-阳性细胞核的定量。单向方差分析（P <0.001，F [3,20] = 82.3），经过事后Dunnett调整。n =每个条件6个大脑。平均值±s.e.m。c，在CA1领域，齿状回和前额叶新皮层的各种PMI处，未灌注（10 h PMI）脑中actCASP3定位的时程分析。在PMI达到1小时时，所有大脑区域都有强大的核定位actCASP3；但是，该信号随PMI的增加而减小。  分析新皮层的细胞结构完整性，神经元形态和密度。 a，前额叶新皮层的Nissl染色，下面的方框部分具有更高的放大倍数，表明BEx脑中保存的神经元结构和解剖细胞结构。比例尺，350μm（顶部），100μm（底部）。图像来自每种情况的代表性大脑；每组n = 6个独立的大脑重复进行实验，结果相似。b，初级运动皮层的Nissl染色显示在BEx灌注条件下保留的Betz细胞结构（箭头），尽管这些细胞在断头后已被轴突化。尽管进行了类似的大脑区域分析，但问号表示由于细胞的急剧分解，Betz细胞身份的不确定性。图像来自每种情况的代表性大脑；每组在n = 3个独立的大脑中重复进行实验，结果相似。c，前额叶新皮质中NeuN（绿色）的免疫组织化学染色的共聚焦平铺扫描。比例尺，50μm。图像来自每种情况的代表性大脑；每组n = 6个独立的大脑重复进行实验，结果相似。d，NeuN染色的最大强度共聚焦投影。神经元在1小时的PMI脑中表现出肿胀的形态，在10小时的PMI和CP条件下（箭头）显示出明显的细胞破坏，而BEx条件下的神经元则表现出典型的细长形态（箭头）。比例尺，50μm。图像来自每种情况的代表性大脑；每组n = 6个独立的大脑重复进行实验，结果相似。e，NRGN染色的最大强度预测（绿色）显示在BEx灌注下（箭头）保留了皮质锥体神经元的典型形态（箭头），在1 h PMI条件下形态呈肿胀状态（红色箭头）。有证据表明在10 h PMI和CP条件下，清晰的细胞破坏以及液泡增大（箭头）。比例尺，50μm。图像来自每种情况的代表性大脑；每组n = 6个独立的大脑重复进行实验，结果相似。f，GAD1染色的最大强度预测（红色）。在10小时的PMI和CP标本中，GAD1染色显示与1小时的PMI和BEx脑相比，收缩的细胞体（箭头）与GAD1阳性的体细胞接触丧失。比例尺，50μm。图像来自每种情况的代表性大脑；每组n = 6个独立的大脑重复进行实验，结果相似。g，前额叶新皮层中存在的神经元细胞数量。由Nissl污点计算得出的数据。单次方差分析（P <0.001，F [3,20] = 224.6），经过事后Dunnett调整；n =每种条件6个大脑; NS，不重要。h，呈现肿胀的椭圆形形态的细胞百分比。从Nissl污点分析数据。单次方差分析（P <0.001，F [3,20] = 16.33），经过事后Dunnett调整；n =每组6个大脑。平均值±s.e.m。i，j，新皮层中NRGN +和GAD1 +细胞的总数。 
有髓新皮质轴突的取向和纤维束密度。 a，前额叶新皮层中MBP的免疫组织化学染色（上图），其高放大倍数图像描绘了纤维的方向和束（下图）。比例尺，100μm（顶部）; 50μm（底部）。图像来自每种情况的代表性大脑；每组n = 6个独立的大脑重复进行实验，结果相似。b，在所有实验条件下，分析与轴突表面有关的单个轴突角。 BEx和10 h PMI大脑显示正交于轴突表面的轴突数量增加，而1 h PMI和CP标本显示以更锐角定向的轴突数量增加。通过两尾χ2分析和d.f的Yates校正进行成对比较。= 1，每对比较分析了786个轴突; n =每个条件3个大脑。BEx与1小时PMI的关系：0-30°时χ2 = 6.403，30-60°时χ2 = 4.341，60-90°χ2 = 18.09; BEx与CP：30–60°时χ2 = 4.341，60–90°时χ2 = 11.39。NS，不重要。c，在整个实验条件下有髓纤维束的密度。 作者通过标记染色和LPS诱导炎症反应的方法来检测神经胶质细胞的结构和炎症性功能是否正常，最后发现：BEx灌注不仅可以维持尸体脑组织中的星形胶质细胞和小胶质细胞数量，还可以维持其炎症反应。 分析神经胶质细胞和炎症反应。 a，免疫荧光染色的共聚焦平铺扫描，检查额叶前额叶皮层中的星形胶质细胞（GFAP；红色）和小胶质细胞（IBA1；绿色）。L1，第1层；L2-6，第2-6层；WM，白质。比例尺200μm。b，GFAP +和IBA1 +细胞的共聚焦最大强度预测。比例尺，50μm。c，d分别是IBA1 +和GFAP +细胞的密度。单次方差分析（IBA1 +：P <0.001，F [3,20] = 38.77; GFAP +：P <0.001，F [3,20] = 28.09），采用事后Dunnett调整；n =每组6个大脑。e，LPS注射的大概位置。f，皮层内注射LPS后前额叶新皮层的多重炎症细胞因子和趋化因子谱分析。 海马中的胶质细胞结构。 a，b，CA1（a）和海马齿状回（b）区域中星形胶质细胞（GFAP;红色）和小胶质细胞（IBA-1;绿色）带有DAPI（蓝色）复染的免疫组织化学染色的共聚焦最大强度投影显示BEx灌注条件下神经胶质细胞结构的保存。与1 h PMI对照相比，BEx样品中的神经胶质细胞表现出更具反应性的形态，且细胞过程增厚。比例尺，50μm。图像来自每种情况的代表性大脑；每组在n = 3个独立的大脑中重复进行实验，结果相似。 作者通过电子显微镜分析发现，与1 h PMI相比，BEx条件下突触前囊泡结构得以保留，并且10 h PMI和CP脑实质性降解。突触前囊泡的定量显示，囊泡池仅在BEx和1h PMI条件下维持正常，而在10h PMI和CP样品中则不复存在。然后，作者进行了电生理检测及脑电图分析，结果也符合上面的规律。 分析突触组织，神经元活动和整体脑代谢。 a，海马CA1原始层内突触的电子显微照片。箭头，突触后密度；橙色阴影，突触前末端。比例尺1μm。b，突触前末端突触小泡的数量。单次方差分析（P <0.001，F [3,8] = 27.13），经过事后Dunnett调整；每个数据点是每个大脑n = 9个突触的平均值;每个条件3个大脑；NS，不重要。平均值±s.e.m。c–e，LPh 4 h后，LOP 6h LOP加BEx灌注液后锥体神经元的电生理特性。c，代表低于和超过阈值的电压迹线，分别响应静态电流为-70 mV的电流的超极化和去极化。刺激大小显示在左侧。 d，由电压依赖性钠和钾通道介导的内向和外向电流族。 e，在-70 mV的保持电位下记录的sEPSC的代表性痕迹。f，ECoG记录BEx灌注大脑的痕迹；来自指定表面电极的代表性等电信号显示在右侧。 g，动静脉梯度和BEx灌注大脑的耗氧量。n = 4个大脑；n =每个时间点每个动脉和静脉样本进行4次配对测量。 作者通过在整个实验过程中比较动脉和静脉样本，最终结果表明，在离体常温条件下， BEx灌注的死后大脑中的整体脑代谢得以恢复。
BEx灌注大脑的动静脉梯度和脑耗氧率。n = 4个大脑；n =每个时间点每个动脉和静脉样本进行4次配对测量。 东风文献速递-浙大二院急诊医学科文献解读团队 关注急诊医学资讯 ↓↓↓ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ · 急诊 · 医学 · 资讯 · 我的2020，与10w+读者一起 观医生医事，学医学知识 |
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