神经简史：糖原贮积病II型发展史

Janegyj 2020-10-23

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糖原贮积病II型（GSD II）亦称Pompe病，是酸性α-葡糖苷酶（GAA）基因突变导致的常染色体隐性遗传代谢性疾病，以骨骼肌和心肌异常糖原沉积为病理学特点，主要引起骨骼肌和心肌功能异常，根据发病年龄、心脏受累和预后，分为婴儿型糖原贮积病II型和晚发型糖原贮积病II型。糖原贮积病II型是有特异性酶替代疗法的罕见病，迄今有85年历史。回顾其临床发现、基础研究、基因诊断、酶替代治疗过程中的里程碑事件，学习先贤们从临床出发、将临床问题带到实验室进行持续研究、再将基础研究成果转化为临床实践的精神，对临床医师开展临床科研具有较好的指导作用。

一、糖原贮积病II型的发现及早期研究

1.婴儿型糖原贮积病II型的发现及描述 荷兰病理学家Joannes Cassianus Pompe（1901-1945年）于1930年对1例疑似死于肺炎的7月龄女婴进行尸体解剖，意外发现其心脏明显扩大，心室壁异常肥厚，其中左心室壁厚度达29mm（正常成人左心室壁厚度7-10mm），心脏重量达190g（正常预计值为39g），制备心脏组织切片后，光学显微镜可见肌纤维呈网眼状，肌纤维间大量糖原沉积；同时对多个组织进行切片，光学显微镜下可见肝脏、肾脏、骨骼肌糖原沉积。Pompe医师于1931年的荷兰阿姆斯特丹医学会议上首次公开报告并讨论该病例，此后，他对病例资料进行整理，相关结果相继发表于1932年的Ned Tijdscr Geneeskd和1933年的Ann Anat Pathol，文题分别为“Over idiopathische hypertrophie van het hart”和“Hypertrophie idiopathique ducoeur”（中文均译为“心脏特发性肥大”）。Pompe医师发表首篇文章的同年，德国医师Putschar和Bischoff各自报告数例死于严重肌无力和心脏肥大伴散在糖原沉积的婴儿病例。Pompe医师将这种病理改变称为弥漫性糖原性心脏扩大（cardiomegalia glycogenica diffusa）。实际上，早在1929年，德国医师von Gierke即报告2例死于肝脏和肾脏异常扩大的患儿，病理学检查发现糖原沉积，但无突出的心脏扩大，此2例后诊断为糖原贮积病Ia型（又称von Gierke病）。Pompe医师认为上述病例均是糖原代谢缺陷所致，将伴心脏扩大的病例研究作为博士课题，并于1936年发表博士论文“Cardiomegalia glycogenica（糖原性心脏扩大）”。第二次世界大战期间（1945年），Pompe医师逝去年轻的生命，鉴于其对疾病的重大贡献，医学界以其名字命名为Pompe病。尽管Pompe医师对疾病进行完整的临床和病理学描述，但医学界对其临床特征尚无定论，诊断标准为何？与其他糖原沉积性疾病的关系？是一种疾病累及不同器官的不同表现，还是不同疾病？这些问题均在当时引起巨大争论。1940年，美国医师Antopol等称Pompe病为心脏扩大型von Gierke病。20世纪40-50年代，随着病例数的日益增多，临床医师对Pompe病临床诊断的认识也越来越清晰。1946年，美国医师Haymond和Giordano报告1例女婴，出生后生长发育无明显异常，但3月龄时突然死于呼吸和心跳骤停，尸检结果显示，大体标本仅见心脏扩大，肝脏和肾脏无明显异常，心脏组织切片光学显微镜可见糖原沉积和结缔组织增生；他们结合该病例对既往病例进行回顾，发现仅部分患者存在心脏损害，因此认为，该病分为两种类型，一种以肝脏扩大为主，一种以心脏扩大为主，从而初步将von Gierke病与Pompe病相区分。1950年，美国医师Clement和Godman以及Di Sant'Agnese等分别报告3例以心脏扩大和肌张力低下为临床特点的糖原贮积病婴儿，同样结合该病例对既往病例进行回顾，提出有无低血糖和酮症可以鉴别糖原贮积病是肝脏扩大型还是心脏扩大型，以心脏扩大为主的糖原贮积病不出现低血糖和酮症，从而进一步将von Gierke病与Pompe病相区分。1955年，黎巴嫩医师Zellweger等报告2例患者，临床表现和病理学特点与Pompe医师的描述相似，在对既往报道的病例进行回顾分析后，认为Pompe病是以心肌和骨骼肌受累为主的疾病，并强调肌肉组织活检术在疾病诊断中的重要作用。迄今，糖原贮积病II型的诊断仍然十分重视肌肉病理改变。经过20余年的研究，截至20世纪50年代末，糖原贮积病被认为是一类疾病而非一种疾病。为更好地进行分型诊断，将Pompe病定义为以显著心脏扩大伴糖原沉积、婴儿期死亡的疾病。1959年，法国医师Jeune等在Pediatrie发表“Anatomicoclinical observation of a case of diffuse cardiac glycogenosis（Pompe's disease）with fibroelastosis of the endocardium”，该文献是首篇以“Pompe disease”为主题词在美国国立医学图书馆生物医学信息检索系统（PubMed）检索到的文献。1963年以后，采用“Pompe病”的文献大量涌现。至此，Pompe病成为最普遍应用的疾病名称。Pompe病的另一个常用疾病名称——糖原贮积病II型又是如何得来的呢？

2. 糖原贮积病的分型 关于糖原贮积病的分型，最早由美国生物化学家、1947年诺贝尔生理学或医学奖获得者Gerty Theresa Cori（1896-1957年）首次发表于1957年的Mod Probl Paediatr，她总结糖原贮积病中已知和未知的酶缺陷类型后，提出根据所缺陷酶的差别进行糖原贮积病分型的原则，并将Pompe病归为糖原贮积病II型。Cori教授是糖代谢领域的顶级专家，与丈夫Carl Ferdinand Cori教授分别于1952和1956年发现糖原贮积病Ia型和III型（亦称Cori-Forbes病）相关缺陷酶。此种分型方法被临床广泛接受，同时也极大地统一糖原贮积病的命名，有利于临床诊断、治疗和科研。

3. 糖原贮积病II型缺陷酶的发现 糖原贮积病Ia型和III型缺陷酶相继发现后，病情最为严重的糖原贮积病II型缺陷酶迟迟未被发现，成为当时的研究焦点。直至1955年比利时生物化学家de Duve等发现溶酶体后，才使得糖原贮积病II型缺陷酶的发现成为可能。1948年，de Duve教授在研究胰岛素是如何通过肝脏糖原的合成与分解以调节血糖时，锁定一种肝脏组织内以葡萄糖-6-磷酸为底物的磷酸酶，但在确定该磷酸酶亚细胞定位时发现一种令人疑惑的现象，即总组织匀浆的酶活性低于各分离成分的酶活性之和，而置于-20℃保存5天后重新测定酶活性，总组织匀浆的酶活性显著升高至预计值；此种现象让他意识到，这种磷酸酶很可能存在于某种生物质膜包裹中，冻存条件使膜结构“老化”，从而将包裹的磷酸酶释放，与底物发挥作用。此后，de Duve教授通过研究大鼠肝脏不同酶的细胞内分布特点，于1955年初步提出“溶酶体”概念，即包裹不同底物特异性酸性水解酶的膜结构细胞器，参与细胞内大分子的消化。此后1年，溶酶体的结构经透射电子显微镜证实。溶酶体的发现打开一个全新的领域，创造出“内吞”、“外排”、“自噬”等全新的概念，de Duve教授亦因溶酶体及其后蛋白酶体的发现而获得1974年诺贝尔生理学或医学奖。溶酶体及其内在一系列酶的发现，直接促进糖原贮积病II型缺陷酶的研究。1963年，de Duve教授研究团队中的1名年轻医师Hers对5例糖原贮积病II型患儿活检或尸检得来的肝脏、心脏、骨骼肌溶酶体酶进行测定，发现GAA酶活性低于正常人群，从而首次将GAA酶缺乏与糖原贮积病II型相联系，GAA酶参与糖原的水解，其缺乏可以导致糖原进行性沉积，最终引起细胞功能障碍而导致糖原贮积病。与此同时，Hers医师提出“溶酶体贮积病”的概念。迄今已有超过50种已知的溶酶体贮积病，而糖原贮积病II型是首个被发现的溶酶体贮积病。

4. 晚发型糖原贮积病II型的发现及描述 糖原贮积病II型被发现后的20余年间，一直认为该病于婴儿期发病，直至GAA酶与糖原贮积病II型的关系被阐明后，存在GAA酶活性下降的轻型病例方明确诊断。1965年，法国医师Zellweger等报告一家系2例以肌无力为主要临床特征的4和15岁男童，无心脏损害表现，均存在GAA酶缺乏，这是首次见诸报道的非经典糖原贮积病II型。此后3年间（1965-1968年），陆续有11例类似病例被报道，就诊年龄为3-19岁，均为儿童期或青少年期发病，以四肢近端肌无力、不伴或仅伴较轻心脏受累、可有呼吸衰竭、同时伴GAA酶缺乏为临床特征。美国梅奥诊所神经科医师Engel和Dale于1968年报告1例46岁男性患者；同年，英国医师Hudgson等报告1例44岁女性患者，于31岁首次分娩后方出现运动功能下降，双下肢近端肌无力缓慢进展，无呼吸和循环功能障碍，肌肉组织活检显示骨骼肌细胞明显糖原沉积，且GAA酶活性显著下降，提示对于育龄期女性糖原贮积病II型患者，分娩可能加重疾病，后续的大样本临床研究亦证实这一观点。此后，Engel医师对成年期发病的糖原贮积病II型患者进行深入研究。1970和1972年，Engel医师及其团队共报告了7例25-46岁的成年糖原贮积病II型患者，总结其临床表现，并比较婴儿期、儿童期、成年期发病的糖原贮积病II型的异同，发现婴儿期发病者病情最重，心脏受累最明显，且GAA酶活性最低；而儿童期和成年期发病者虽然临床表现个体差异较大，但均以近端肌无力为主要特征，无或仅有较轻的心脏受累表现，尚存一定的GAA酶活性。此后，婴儿型糖原贮积病II型和晚发型糖原贮积病II型（包括儿童型、青少年型和成年型）这两种同为GAA酶缺乏但临床严重程度差异较大的疾病表型逐渐被广泛接受。

二、糖原贮积病II型发病机制研究

1. 致病基因的发现 虽然20世纪60年代即发现糖原贮积病II型系GAA酶活性缺失所致，但其致病基因——GAA基因直至1979年方由英国牛津大学遗传学家Solomon等在染色体上准确定位，他们采用糖原贮积病II型患者皮肤纤维母细胞系与小鼠肾腺癌（RAG）细胞系进行体细胞杂交，杂交细胞在分裂过程中逐渐丢失人类染色体，通过测定丢失不同人类染色体的杂交细胞的人GAA酶水平，最终定位GAA基因于第17号染色体。同年，法国医师Weil等将带有第17号染色体与第2号染色体平衡易位的人纤维母细胞系与小鼠细胞系进行体细胞杂交，进一步定位GAA基因于染色体17q21靠近端粒区域。1984年，美国纽约大学医学院Hirschhorn教授研究团队同样将带有第17号染色体与第20号染色体平衡易位的人纤维母细胞系与小鼠细胞系进行体细胞杂交，进一步精确GAA基因的定位，结合Weil等的实验结果，精确定位GAA基因于染色体17q21-25。此后1年，Hirschhorn教授研究团队再次采用人与小鼠体细胞杂交技术，将GAA基因进一步精确定位于染色体17q21-23。GAA基因的定位逐渐精确，促进GAA基因的克隆。1986年，Hirschhorn教授研究团队采用抗人GAA酶抗体对人肝脏cDNA文库进行筛选，发现GAA-67这一长度为2×103bp的cDNA片段是GAA基因所在片段；他们将此cDNA片段与来自3例糖原贮积病II型患者（2例婴儿型、1例晚发型）的mRNA进行杂交，结果显示，3例患者的杂交条带所在位置各不相同，表明3例患者的GAA基因mRNA长度各不相同，初步探讨GAA基因突变的多样性。1988年，荷兰遗传学家Hoefsloot等参考Hirschhorn教授的方法也成功克隆出GAA基因cDNA，并首次对GAA基因cDNA片段及其所转录翻译的氨基酸序列进行测序，绘制出首份人GAA基因DNA序列图和GAA酶氨基酸序列图。1990年，Hirschhorn教授研究团队对其之前分离的GAA基因cDNA片段也进行测序，并与Hoefsloot等的测序结果比对，发现GAA基因存在3个变异较大的区域。GAA基因序列的确定开启糖原贮积病II型的分子诊断，其突变谱逐年增加，常见突变逐渐被发现，如高加索人的c.-32-13T>G剪切突变、中国人的c.2662G>T和c.1935C>A突变。关于基因型与临床表型的关系研究显示，c.-32-13T>G和c.2238G>C突变与晚发型糖原贮积病II型有较强的相关性，也可见于婴儿型糖原贮积病II型。此外，p.Gly576Ser被发现可以导致GAA酶活性假缺失，即GAA酶活性显著下降而肌肉组织无糖原沉积。然而对GAA基因型与临床表型关系的认识仍不足，尚待进一步验证。

2. 疾病模型的建立 GAA基因的克隆除有助于糖原贮积病II型的明确诊断，还直接促进疾病模型的制备。尽管糖原贮积病II型日本鹌鹑模型可模拟部分病理改变和临床表型，但鸟类与哺乳动物的巨大差别促使更优化的哺乳动物模型的研发。1998年，荷兰Bijvoet等和美国Raben等首次成功制备糖原贮积病II型小鼠模型，即GAA基因纯合敲除小鼠、GAA基因外显子6纯合缺失小鼠和GAA基因外显子13纯合缺失小鼠，其中，后两种模型具有糖原贮积病II型的病理学特点，但临床表型不明显；GAA基因纯合敲除小鼠模型的临床表型、病理学特点均与糖原贮积病II型患者相近，是较好的糖原贮积病II型动物模型。此外，糖原贮积病II型模型小鼠肌肉细胞、诱导型多能干细胞（iPSCs）等体外细胞模型也相继建立。上述小鼠模型极大推动糖原贮积病II型发病机制和治疗方法的研究，但是由于小鼠与人的种属差异较大，糖原贮积病II型小鼠模型的临床转化难度较大。2011年，中国台湾地区Huang等发现，成功建立的糖原贮积病II型患者诱导型多能干细胞可以分化为肌细胞，为糖原贮积病II型的研究提供人的试验平台，从而弥补糖原贮积病II型小鼠模型的不足。

3. 发病机制 自糖原贮积病II型与GAA酶缺乏相关被发现后，GAA酶活性下降认为是糖原贮积病II型的发病原因，但其作用机制尚未阐明。晚发型糖原贮积病II型均存在GAA酶缺乏，但临床表型差异较为明显；此外，经酶替代治疗的糖原贮积病II型模型小鼠和患者临床症状改善但无法完全恢复，表明阐明糖原贮积病II型的发病机制是十分重要的。糖原贮积病II型作为溶酶体功能障碍性疾病，Hers医师在阐述其与GAA酶关系时即提出，自噬可能在其发病过程中发挥重要作用。自噬是细胞内大分子回收过程，自噬体通过与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将大分子水解成小分子重新利用或排出胞外。1970年，Engel通过形态学和生物化学验证自噬和线粒体功能障碍参与糖原贮积病II型的发生与发展。关于自噬的研究进展十分缓慢，一方面，一直未找到良好的自噬标志物；另一方面，当时的研究热点是致病基因克隆和酶替代疗法。直至注意到GAA酶替代治疗的疗效差异，研究者们方重新重视对糖原贮积病II型发病机制的研究。2000年，日本细胞生物学家Kabeya等的研究显示，微管相关蛋白1轻链3（MAP1LC3）可以作为哺乳动物细胞中反映自噬的标志物，此发现为自噬研究打了一剂强心剂。此后，两种亚型MAP1LC3表达变化成为反映自噬的标记。美国Raben教授研究团队对糖原贮积病II型的自噬进行大量研究，并于2006年首次发现糖原贮积病II型模型小鼠肌肉组织存在自噬通路异常，自噬的差异与Ⅰ型和II型肌纤维对GAA酶的不同反应相关，过度上调的自噬可能影响酶替代治疗效果；次年在结合既往研究的基础上，提出自噬在糖原贮积病II型发病中发挥重要作用，无论是在模型小鼠还是患者肌肉组织中均发现自噬增高，且增高的自噬破坏肌肉横纹，可能是导致肌肉功能障碍的原因。后续研究也进一步证实自噬在糖原贮积病II型发病中的作用，尽管迄今对自噬参与糖原贮积病II型的发病机制仍未完全清楚，其对于糖原贮积病II型是疾病过程中的原因还是结果仍存争议，但可以肯定的是，自噬在糖原贮积病II型发生与发展中发挥重要作用。

三、糖原贮积病II型的诊断与预防

糖原贮积病II型患者除肝脏、肌肉组织GAA酶活性下降外，1963年荷兰医师Huijing等还发现，糖原贮积病II型患者外周血白细胞GAA酶活性显著下降。由于该项检查方法取材方便、创伤小、检测快速等优势，广泛应用于糖原贮积病II型的临床诊断，并不断进行技术改良。但是该项检查方法存在偏倚的可能，美国和日本的糖原贮积病II型诊断与治疗指南仍推荐皮肤纤维母细胞或肌肉组织GAA酶活性测定作为诊断的“金标准”。

GAA酶活性测定可以用于糖原贮积病II型的产前诊断。1969年，美国儿科医师Nadler和Messina首次对曾生育过糖原贮积病II型患儿的8例再次妊娠女性进行羊水穿刺，测定羊水细胞GAA酶活性，结果显示，1例GAA酶活性缺失，终止妊娠，遂对胎儿进行尸检，在胎儿的所有器官中均发现GAA酶活性缺失，证实羊水细胞GAA酶活性测定在糖原贮积病II型产前诊断中具有重要价值。尽管仅凭GAA酶活性进行产前诊断被认为可能存在如母体组织污染等问题，但仍然是糖原贮积病II型产前诊断的重要参考之一。此外，基于目前已知的基因型-临床表型关系，GAA基因检测也广泛应用于产前诊断，弥补羊水细胞GAA酶活性测定的不足。

四、糖原贮积病II型的酶替代治疗研究

对于溶酶体贮积病，酶替代疗法最早于1964年由de Duve教授提出。尽管1963年即明确糖原贮积病II型与GAA酶缺陷相关，但酶替代疗法直至1973年方进行首次尝试。静脉应用源自胎盘的高度纯化GAA酶，但免疫排斥反应和有限的治疗效果限制其临床应用。此后，如何制备优质的人GAA酶成为研究热点。1995年，Fuller等成功采用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞首次制备GAA酶前体物质。1996年，陈垣崇教授研究团队采用相同细胞成功研发重组人酸性α-葡糖苷酶（rhGAA），且纯化后的产量较高，极具临床应用前景。同年，Bijvoet等采用转基因兔成功从兔奶中制备rhGAA。此后，研究者们对两种来源的rhGAA进行相应临床前试验和临床试验，但转基因兔奶中提取的rhGAA经过一系列动物实验和临床试验后未推进至III期临床试验，究其原因，推测与rhGAA产量较低和成本较高有关。

通过CHO细胞系成功制备rhGAA后，1998年，陈垣崇教授研究团队在糖原贮积病II型日本鹌鹑模型中发现，rhGAA可改善运动功能和肌肉、肝脏病理改变；此后，Raben等也在GAA基因敲除小鼠模型中证实rhGAA的治疗效果。2001年，陈垣崇教授研究团队开展rhGAA治疗婴儿型糖原贮积病II型的I和II期临床试验，予3例2-4个月的糖原贮积病II型患儿rhGAA5mg/（kg·次）、2次/周，治疗1年，结果显示，所有患儿均生存，心脏病变明显好转，均未见明显不良反应，其中1例运动功能明显改善，肌肉组织活检发现骨骼肌糖原沉积戏剧化减少；尽管1例后因药物剂量过大［10mg/（kg·次）、2次/周］而出现肾病综合征，但总体而言，rhGAA可以使患者受益。2006年，rhGAA II期临床试验结果发表于J Pediatr，8例婴儿型糖原贮积病II型患儿接受为期52-153周的rhGAA静脉滴注，其有效性和安全性均较好。2007年，III期临床试验显示，18例婴儿型糖原贮积病II型患儿均生存至1岁6个月，心脏功能和运动发育改善，肌肉GAA酶活性增高，糖原沉积减少，虽然出现某些不良事件，但均未严重到停药。经过10年的临床前试验和临床试验，美国食品与药品管理局（FDA）于2006年批准源自CHO细胞系的rhGAA上市，用于婴儿型糖原贮积病II型的治疗，产品名为Myozyme。但仍有一些问题尚未解决，如III期临床试验中40mg/kg隔周给药较20mg/kg隔周给药并未见更多获益，但2013年van Gelder等研究显示，rhGAA 40mg/（kg·周）较20mg/（kg·周）效果更佳。因此，rhGAA治疗婴儿型糖原贮积病II型的最佳剂量尚待进一步研究。此外，长期予rhGAA无可避免地产生抗rhGAA抗体，高滴度的抗体可严重影响治疗效果，如何延缓抗体的产生是亟待解决的问题。2017年，Chen等对rhGAA治疗婴儿型糖原贮积病II型进行Cochrane系统评价，结果显示，rhGAA长期给药可以使患者受益，但也提出药物剂量、抗体产生、自身GAA产生等因素对治疗的影响。因此，rhGAA治疗婴儿型糖原贮积病II型尚待进一步规范、严格的随机对照临床试验阐明并解决上述问题。

源自CHO细胞系的rhGAA除应用于婴儿型糖原贮积病II型外，对晚发型糖原贮积病II型也有临床价值。目前，某些临床观察性研究结果显示，rhGAA对晚发型糖原贮积病II型有疗效。2010年，一项针对90例>8岁的晚发型糖原贮积病II型患者的大型随机对照临床试验结果显示，rhGAA 20mg/kg静脉滴注78周后，运动功能和呼吸功能明显改善，且未出现明显不良反应。同年，美国食品与药品管理局批准源自CHO细胞系的rhGAA上市，用于治疗晚发型糖原贮积病II型，产品名为Lumizyme。2016年，针对rhGAA治疗晚发型糖原贮积病II型的探索性肌肉组织活检评价（EMBASSY）研究结果发表，该项研究主要用于探讨rhGAA治疗后肌肉病理学、影像学和功能改变，结果显示，60例予rhGAA 20mg/kg隔周静脉滴注、连续6个月的晚发型糖原贮积病II型患者中，18例肌肉糖原沉积减少，虽然肌肉MRI未见明显改变，但运动功能均改善，且未见严重不良事件。

总之，糖原贮积病II型酶替代疗法的提出、发明和发展无论是从科学角度还是商业角度均非常成功，值得其他疾病治疗方法研究的借鉴。

五、总结

本文回顾糖原贮积病II型研究进展里程碑事件（表1）。糖原贮积病II型在临床和科研人员的不懈努力下，成为目前少数可治性遗传性肌肉病。糖原贮积病II型研究历程一方面鼓舞其他疾病的研究，另一方面对其他疾病的研究有借鉴作用。值得注意的是，尽管糖原贮积病II型研究取得阶段性胜利，但仍有众多问题尚未解决，尤其是发病机制仍有许多疑问，尚待继续研究，以期早日完全攻克糖原贮积病II型的治疗难题。