蛋白互作知识的第二弹——Pull-Down。如果把蛋白互作比作是一次兴趣盎然的“钓鱼”活动的话,那我们用的Purekine填料就是一个坚韧又细长的“鱼竿“和”鱼线“,已知的GST标签重组蛋白是锐利而坚挺的“鱼钩”与“鱼饵”的完美结合,而我们的目标蛋白就是那个在水里自由灵动的“鱼儿”了。 Pull-Down的概念与Co-IP类似,其目的是研究与已知诱饵蛋白结合的蛋白或配体。Pull-Down旨在证明两种蛋白质之间的相互作用或探索可与目的蛋白结合的未知蛋白或分子。Pull-Down不同于IP或Co-IP之处在于,它不是基于抗体-抗原相互作用,不是免疫反应。诱饵蛋白(或配体),通过非抗体亲和系统固定到固相支持物上,这种固定可以通过共价偶联结合到活化的微珠上,也可以通过与支持物上的受体分子结合的亲和标签结合,从而固定。 例如,固定化金属螯合亲和层析(IMAC)树脂,可用于组氨酸标签诱饵蛋白的Pull-Down。Pull-Down的优化需要考虑所采用的亲和系统的特殊性质。Pull-Down的原理根据以下示意图,大家就会一目了然: 而Pull-Down所获得的捕获蛋白的分析方式,如下图所示: Pull-Down与蛋白纯化实验的对比: 运用重组基因表达蛋白,再进行下游的蛋白的提取和纯化实验: 两种实验步骤的异同点解析: 需要实验到的产品类型:
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