本文为brainnews团队原创,转载请联系授权。 由于大脑的复杂性,单薄的脑切片已经渐渐无法满足研究需要。细胞分布,连接模式,活动模式的研究等等都需要全脑成像。 除了可以用常用的系列切片模拟Z轴达到深度成像的目的以外(Seiriki et al., 2017),本文介绍时下几种脑组织透明化技术,使成像更清晰,也为成像提高更高的分辨率。 以下透明化技术都是为了在激光荧光显微镜(比如Light-sheet Fluorescence Microscopy, Specific Plane Illumination Microscopy 等)下成像而准备。 1. BABB (Dodt et al., 2007) 最早的尝试可以追溯到十一年以前,维也纳科技大学的研究者初次使用苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物作出了视觉化完整的老鼠脑神经网路的第一次实验。 他们同时纪录了标记了的绿色荧光体和脑内天然的绿色荧光体,b-d的量尺依次从500微米,200微米到5微米。 图d为以更高分辨率3D重构整个海马中CA1椎体神经元的树突。标本非常成功地变透明了,也非常适合显微镜下成像。然而此技术使用的透明媒介使研究者作的荧光标记迅速消失,以至于不适合多次观察。 原文链接: https://www./articles/nmeth1036 2. CLARITY (Chung et al., 2013)
K为鼠脑海马的3D成像,每一个颜色都为不同的抗体标记
3. Scale (Hama et al., 2011)
适用性广泛,之前的技术都很容易在透明处理的时候把荧光标记也洗掉,但scale不仅能保留荧光记号,还能保留组织的体积,在此基础上还能有效地透明化脑组织。此试剂也成为了后续多项透明脑试剂方法的基础。
原文链接: https://www./articles/nn.2928#f1 4. CUBIC(Susaki , 2014) 研究者重新审视卓有成效的ScaleA2溶液中的化学成分,并更改实验步骤,交换了固化和分离的步骤,加入了一步均质化,使得用多种试剂处理同一个脑成为可能。 他们还注意到了PH值在保留荧光标记上的重要性,开发了一种叫Scale CUBIC的试剂。通过多次尝试和优化,最后成功应用于脑区块的免疫组化并兼容各种指示剂蛋白。
此技术可以用相对廉价的实验成本来实现单细胞精度的全脑显像,保存原子级的脑部结构。研究者可以用于研究和对比脑结构,神经网络等。这在动态研究中非常有用。 原文链接: https://www./science/article/pii/S0092867414004188#bbib16 5. PACT和PARS (Yang et al., 2014) 此技术并不局限于透明化脑组织。 研究者使用了一种折射率耦合试剂,和昂贵的FocusClear(在CLARITY中使用)效率相差无几,此被动透明技术被称为PACT。此技术也可用于全身细胞的标记和透明化,用于全身细胞的技术被称为PARS。
原文链接: https://www./science/article/pii/S0092867414009313 6. ScaleS (Hama et al., 2015)
他们综合Scale,Scale CUBIC和PARS技术,考量了PH值和折射率,最终完成了ScaleS。 在透明化的同时免疫组化染色,告别了染色后的组织透明化不是非常理想,和透明化后染色时间太长的弊端。使用SQ(5)技术可以迅速透明化组织,最短数小时就可达到效果。
原文链接: https://www./articles/nn.4107#abstract 7. iDISCO+ (Renier et al., 2014; Renier et al., 2016) iDISCO+通过简化实验步骤,缩短透明化时间到一天,整个实验步骤按照组织大小从8天到18天不定,比起之前步骤都要几周已经是很大的进步了。 原文链接: https://www./science/article/pii/S0092867414012975
原文链接: https://ac./S0092867416305554/1-s2.0-S0092867416305554-main.pdf?_tid=a2d54fe4-b311-4fd7-9120-707b1f193362&acdnat=1527600914_c6db34e19ba70bcfddf9ae8a9d3d569d 【1】Chung, K., Wallace, J., Kim, S. Y., Kalyanasundaram, S., Andalman, A. S., Davidson, T. J., … & Pak, S. (2013). Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 497(7449), 332. 【4】Hama, H., Hioki, H., Namiki, K., Hoshida, T., Kurokawa, H., Ishidate, F., … & Miyawaki, A. (2015). ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature neuroscience, 18(10), 1518. |
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