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慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因 治疗载体。和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该 载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。并且它可以有效地 感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因 此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒被广泛地应用于 RNAi 的研究中。由于体外合成 siRNA对基因表达的抑制作 用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA的载 体, 然后转入细胞内转录 siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成 siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。但上述两种 方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些 基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。利 用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的 RNAi具有下述优点： ● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。 ● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达 siRNA的元件，siRNA 表达效率比较均一，因 此，无需挑取单克隆。 ● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin 可以在 2-3天内杀死细胞， 只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。 慢病毒表达载体中，是由 RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA合成的，这是因为 RNA聚 合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA不会带 poly A尾。当 RNA聚合酶Ⅲ遇到 连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3’端形成 1~4个 U。U6 和 H1 RNA启动子是两种 RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的 上游，适合于表达～21nt RNA和～50nt RNA茎环结构（stem loop）。在 siRNA表达载体 中，构成 siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有 1~4 个 U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA |
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