【原】【干货】慢病毒包装教程

慢病毒（Lentivirus） 是逆转录病毒的一种，它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而大大增加了感染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。

(慢病毒)

慢病毒载体可将外源基因/shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

（包装过程模式图）

详细流程

慢病毒的储存

短时间内使用可将病毒暂时放置于4℃保存（请尽量在三天内用完），如需长期保存需放置于-80℃。

注意事项：

病毒可在-80℃储存6个月以上，但如病毒存储时间超过6个月，在使用前需重新滴定病毒滴度；

反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%，因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融建议按照每次的使用量对病毒进行分装；

慢病毒的优势

慢病毒能够感染多种难以感染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分裂细胞（神经元细胞）等；

慢病毒能将外源基因整合到细胞基因组中，稳定表达外源基因；

慢病毒感染筛选稳定细胞株所需时间较短；

免疫原性低，安全性高。

慢病毒包装常见问题

Q1.

什么是MOI值？

MOI(病毒感染复数)，一般认为其是一个比值。MOI的含义是感染时病毒与细胞量的比值，即MOI=病毒滴度x体积/细胞数量。

Q2.

慢病毒如何稀释？

根据MOI值，用常规培养基/生理盐水/Hanks/PBS液等将慢病毒稀释到需要的滴度(可按照10倍梯度稀释)。

Q3.

Q3.加入慢病毒后，细胞死亡，如何处理？

这种情况是由于慢病毒对细胞具有一定的毒性，需要调整并降低感染的MOI值，并且感染后，定时观察细胞状态，若细胞状态差，则需对细胞进行换液操作，用新鲜的完全培养基替换病毒感染培养液。

Q4

如何确定慢病毒感染靶细胞的感染效率？

慢病毒感染靶细胞的感染效率可通过qPCR检测靶细胞中的慢病毒载体拷贝数来计算。另外如果构建的慢病毒载体带有标记基因（如GFP、RFP等）则可以通过荧光显微镜下观察进而评估感染效率。

Q5.

慢病毒感染细胞后什么时候的基因表达到达峰值？

细胞感染后48-72 h能够观察到荧光，部分难感染的细胞需要96 h或更长，可进行抗性筛选增加阳性细胞比例。

（病毒感染示意图）