【原】奇妙的发现-RNAi，及其在医学上的应用

RNAi(RNA interference，RNAi)是通过实验手段向细胞内导入双链RNA(double-stand RNA，dsRNA)或者细胞内源性产生一些短片段的双链RNA，这些短片段的双链RNA通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因的表达，使细胞出现特定基因缺失的表型。由于这种现象的作用为点发生在转录后，故又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。

小的干涉RNA(small interfer-ence RNA ,siRNA) 是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个核苷酸组成，就是这种短片段双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA，最终使相应的基因沉默，达到抑制蛋白质翻译的目的。

RNAi(RNA interference，RNAi)给基因功能研究带来了巨大的技术革新，是基因功能研究和基因治疗研究的热点，对生物学和医学领域产生了难以预料的影响。在2001年被《Science》杂志评为最重要的成果之一；在2002年《Nature》杂志将RNAi评为年度重大科技成果之一。Craig Mello也因为在RNAi研究上的卓越贡献而获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。何谓RNAi？也许要从RNAi的发现开始讲起！

△ Craig Mello

奇妙的发现

1990年由Jorgensen研究小组在对矮牵牛（petunias）进行的研究时，研究人员将编码紫色色素的多拷贝基因转入矮牵牛中，但是结果却令他们大吃一惊。矮牵牛并没有产生预期的深紫色花，相反的，却产生了白色和白紫色杂色的矮牵牛花。研究人员很奇怪为什么不但没有产生深紫色的花，连花本身的淡紫色都被抑制，产生了白色花。这种现象被命名为协同抑制（cosuppression），顾名思义就是导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制了。

1992年，Romano在粗糙链孢霉(Neurospora crassa)中发现，外源导人基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。研究人员对dsRNA能够导致基因沉默引起高度重视是在1995年。1995年Guo和Kemphues博士也在秀丽新小杆线虫中发现了RNA的干扰现象。Guo试图证明par-1基因的失活会破坏线虫第一次卵裂的不对称性，她在关闭par-1基因的表达时使用了反义技术，即注入反义RNA，使反义RNA和par-1基因的转录物杂交，从而阻断蛋白的翻译过程。但令她惊讶的是在她的对照试验中顺义RNA也同样使par-1基因的表达沉默了。但Guo并不能对此现象作出合理的解释，直到1998年，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello才揭开这个未解之谜。Mello等人通过注射与秀丽新小杆线虫机体同源基因（靶基因）的双链RNA，阻断了靶基因的表达。并将其命名为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。Mello等人将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA能够高效地特异性阻断同源基因的表达。

随后关于RNAi现象的研究表明，在植物、果蝇、锥虫、涡虫等许多生物中都存在此种现象。1999年，Tuschl等研究人员报道了在哺乳动物中也存在RNAi现象，只是导入的RNA是一种小的干扰RNA（small interfering RNA; siRNA）。2001年，Berstein等研究人员提出，只有22个核苷酸的siRNA才能特异性的阻断dsRNA，同时Berstein还在体内发现了一个分解dsRNA为siRNA的酶，称为DICER酶。

RNAi作用机制与研究

RNAi的作用分为3个阶段：起始阶段、效应阶段、扩增阶段。

dsRNA可以是一个单链RNA分子回折，自身互补形成分子内双链；也可以是分开的2个RNA分子互补形成的分子间双链。当细胞中的dsRNA扩增达到一定量时，可以被特异性的双链RNA内切酶——Dicer酶识别，在ATP的参与下被切割成约21～23个核苷酸的片段，形成siRNA分子，然后识别生物体内与之同源的靶mRNA序列，启动RNAi效应。siRNA与特异性蛋白结合后解链，其反义链与核酶复合物内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白4种组分结合，形成诱导RNA沉默的复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。在ATP的激活下，活化后的RISC通过碱基配对的方式结合到生物体内的靶mRNA上。细胞中的RNA可以在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRPs）作用下，以siRNA为引物，目的mRNA为模板合成大量的dsRNA，后者又可作为RISC的底物而被降解形成新的siRNA，新siRNA又可以进入上述循环，使信号放大。此外，siRNA还可以在RdRPs的催化下进行自我复制，从而放大其生物学效应。

科研人员并不满足于简单的发现了RNAi的作用机制。一种新技术发现的最大价值在于实际上的应用。2006年5月《Nature》杂志首次发表RNAi在非人类灵长类动物中的试验结果。研究人员通过RNAi技术沉默了一个相关致病基因，这项研究成果为开展后续研究提供了重要依据。来自全球领先的RNAi疗法公司Alnylam Pharmaceuticals的Tracy Zimmermann和其他研究人员设计了载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）基因的siRNA。载脂蛋白B主要在肝和小肠中表达，参与低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的合成、装配和分泌。载脂蛋白B水平的增高会导致心血管疾病的患病风险增加。用传统的药物治疗方法很难控制载脂蛋白B的水平。研究人员将siRNAs包裹在核酸脂肪微粒（nucleic acid lipid particles）中，同时包被外壳以防止siRNA被降解。将这种siRNAs静脉注射到短尾猴中（cynomolgus monkeys），单次剂量1mg/kg或者2.5mg/kg；给予单一剂量siRNA注射24小时后，载脂蛋白B、血清胆固醇和低密度脂蛋白水平明显降低；注射48小时后，载脂蛋白BmRNA最大沉默量超过90%以上。

这是首次在非人类灵长类动物中单次单剂量给予siRNA的相关研究。经过11天的观察，人们看到了siRNA在治疗疾病上的潜力，但这次试验由于是单一剂量，需要进一步的多剂量相关数据，证明RNAi治疗的安全性。

2007年在《Nature》杂志上John Matthias等人发表了一篇文章，该文章研究表明RNAi介导的基因沉默并不会干扰内源性miRNA路径。

在John Matthias等人发表的新成果中，研究人员在啮齿类动物身上给予合成的siRNA可以有效抑制肝细胞靶基因表达，获得治疗性的基因沉默效果，并不会影响内源性的miRNA的途径。在前期RNAi的研究中，研究人员都是利用逆转录病毒传递编码shRNA的基因，进一步加工成siRNA，一旦这个基因结合到细胞DNA上，shRNA就会合成，从细胞核传递到细胞质。有研究表明，大量的shRNA会阻断细胞miRNA路径，影响miRNA的水平和活性。由于没有正常的功能性miRNA，小鼠会死亡。曾经也有研究人员给予低剂量的shRNA，但因为一旦shNRA基因结合到宿主细胞DNA上，它的表达期限就很长，虽然解决了毒性反应问题，但剂量难以调控，应用上依旧会存在问题。John Matthias等人是将合成的siRNA直接传递到细胞质，不会影响内源性miRNA水平和活性。

研究人员给予的合成siRNA主要靶基因是肝细胞的两个特殊基因：载脂蛋白和因子VII，研究表明设计合成的siRNA能有效抑制80%的靶基因，而且对肝细胞表达的内源性miRNAs（miR-122、miR-16、let-7a）的水平和活性无明显影响。而且仓鼠的重复给药实验也表明，给予siRNA可以使Scap基因获得长时间的基因沉默，而对内源性miR-122的水平无任何影响。这项动物试验证明了直接给予合成的siRNA是一种具有潜力的、安全有效的治疗方法，对于一些难治性的疾病如癌症也提供了一种新的治疗思路。

三种传递siRNA方法

从发现至今，科学家希望能阻断基因表达的RNAi技术可用于治疗目前无法解决的疑难疾病。

毫无疑问RNAi具有巨大的治疗潜力，但是利用RNAi技术治疗存在一个巨大的障碍，那就是如何安全有效地将siRNA传递到特定的体内靶细胞中去。

纽约爱因斯坦医学院的Cy Stein博士称，大自然不欢迎外源的寡核苷酸进入细胞，这可以说是生命的底线之一。

目前传递siRNA的方法层出不穷，总体概括可以分为三类：DNA或者病毒载体、定点注射以及合成修饰包装成胶囊。在这三种方法中，利用DNA重组技术看似是最好的方法，但是利用DNA或者病毒载体只是一味的解决了投递过程的瓶颈问题。利用DNA或者病毒载体能够成功的敲除某个细胞里的基因，但是这种方法会把正常组织细胞里的基因也抑制掉，在这个敲除的过程中，特异性有待商榷。

科学家针对上述特异性的问题提出了针对特定的组织局部传递siRNA的直接方法，即定点注射。定点注射对于某些单一基因引起的疾病是最佳的选择。但很多疾病是由多种基因引起，这样多数疾病的靶基因都不适合用DNA重组技术和直接传递技术。

经过科学家的多年努力，卓有成效的是第三传递方法即合成修饰包装成胶囊。2009年《Nature》杂志报道了关于传递siRNA新方法的文章。麻省大学医学院分子医学系Myriam Aouadi等人找到了一种安全有效的将siRNA传递到巨噬细胞中的方法。研究人员选择巨噬细胞是因为巨噬细胞一直是RNAi治疗的研究热点，而且巨噬细胞可以促进多种疾病的炎症反应,例如类风湿关节炎、肠炎和糖尿病。研究人员用β1，3-D葡聚糖包裹siRNA，被包裹的siRNA在体外和小鼠体内均具有沉默基因的作用。研究人员给由脂多糖诱导的炎症模型小鼠口服这种包含siRNA的葡聚糖颗粒，最少siRNA剂量为20ug/kg，siRNA消耗巨噬细胞中TNF-α的mRNA，降低血清中TNF-α的水平。研究发现接受了葡聚糖-siRNA颗粒治疗的小鼠存活率提高，能有效抑制全身性炎症。这一新的RNAi技术为研究人员研发其他类型的siRNA药物提供了一个很好的思路，为应用RNAi治疗疾病扫清了siRNA安全有效传递的障碍。

RNAi在医学上的应用

从1990年第一次在植物中发现了RNAi现象到2001年《Nature》首次报道哺乳动物培养细胞中通过siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默，RNAi技术已经成为一项有巨大医学应用潜力的前沿技术，已经成功的从植物研究发展到哺乳动物的相关研究。

在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。由于RNAi可以使特异的mRNA发生沉默，获得功能丧失或基因突变株。与传统的基因敲除方法相比，RNAi的方法具有明显优点——高效、周期短、特异性强、操作简单。例如在生产转基因动物上，使用RNAi方法培育转基因敲除小鼠只需要4个月时间，用传统的方法生产基因敲除小鼠至少需要一年时间、甚至更久，RNAi比传统的敲除方法具有更多的优势。

从RNAi的功能基因组研究到治疗的试验性研究，科学家经过了一个艰辛的过程。RNAi最主要的医学应用表现在对病毒、肿瘤的治疗方面。2002年Lee等人在《Nature Biotechnology》发表的研究表明，用siRNA抑制艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的一些基因，如p24、vif、nef、tat、rev可阻止HIV在细胞内复制；抑制HIV的受体CD4和CD8a或辅助受体CXCR4或CCR5或病毒结构Gag蛋白的表达，可阻碍HIV感染细胞。同年，Novina等人在《Nature Medicine》上发表文章，称在实验中针对人类免疫缺陷病毒合成的siRNA可特异地沉默HIV-1细胞受体CD4、病毒结构蛋白Gag和调节蛋白Nef。研究结果显示siRNA可以有效抑制HIV-1复制周期的每个环节。RNAi技术不但可以应用在HIV上，在乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）上的报道也层出不穷。2003年McCaffrey等人主要针对HBV基因组设计siRNA，通过转染HBV siRNA表达质粒后，研究人员发现在小鼠肝脏中HBV成功受到抑制。

肿瘤是一种难治性疾病，用传统药物治疗的效果并不显著。新技术的出现必然带动疾病治疗方法上的革新，渐渐的用RNAi方法治疗肿瘤成为了研究的热点。2007年Heidel等人通过对短尾猴静脉注射包含针对核糖核苷酸还原酶M2亚基的siRNA的微粒，剂量3～9mg/kg siRNA。研究结果显示短尾猴在3～9mg/kg siRNA剂量下有很好的耐受性。在27mg/kg siRNA剂量下，血清尿素氮和肌酐水平升高，具有肾毒性；转氨酶有轻度升高，具有轻微肝毒性。这种肝肾毒性主要由于siRNA剂量升高引起。动物试验的可喜结果让一些药物公司也投入了siRNA药物研发的行列中，由Calando Pharmaceuticals公司申请的CALAA-01药物治疗实体肿瘤的安全性临床试验正式启动。CALAA-01药物的活性成分是siRNA，包被在颗粒中防止核酸降解，以便顺利到达肿瘤细胞靶基因。siRNA的主要靶基因是核糖核苷酸还原酶M2亚基，siRNA通过RNAi作用降低核糖核苷酸还原酶M2亚基的表达，达到抑制肿瘤生长，缩小肿瘤体积的作用。目前试验处于进行阶段，试验结果值得期待。

RNAi从发现到应用是每一个新技术必经的发展历程。在RNAi的应用过程中，遇到研发瓶颈等问题，在所难免。但RNAi导入率不高、稳定性差并不能掩盖它的诸多优点。RNAi不仅推动了后基因组时代的发展，在发现疾病相关基因、疾病治疗和药物筛选研发上都起到了积极的作用。