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论文：MIWI and piRNA-mediated cleavage of messenger RNAs in mouse testes（MIWI和piRNA介导的小鼠睾丸信使RNA切割） 摘要以介导转座子的表观遗传沉默而闻名。最近的研究表明，这一功能也涉及到pRNA引导下转座子转录本的切割。 由于许多pRNAs似乎也具有针对多种mRNAs的能力，这就提出了一种有趣的可能性，即piRNAs可能作为siRNAs广泛地降解特定的mRNAs。 为了直接验证这一假说，我们将小鼠PIWI(MIWI)相关的piRNAs与实验鉴定的小鼠睾丸中切割的mRNA片段进行了比较，并观察到主要发生在5‘端5’端的切割位点。 我们还注意到在核苷酸位置1和10的U和A残基在pRNAs和mRNA片段中的强烈偏倚，其特征类似于“乒乓”循环中的piRNA扩增模式。通过剪贴器-seq和基因表达谱分析，我们发现许多潜在的pRNA靶向mRNAs与miWI直接相互作用，并在睾丸中表现出较高的表达水平。 米维催化突变小鼠基于报告的分析进一步揭示了pRNAs与mRNA靶点之间碱基配对的重要性，以及miWI在pRNA介导的靶抑制中对切割器活性和pRNA载量能力的要求。 重要的是，我们证明了某些关键的pRNA靶点的适当翻转对于精子的形成是必不可少的。这些发现共同揭示了iRNA在小鼠睾丸中的作用及其对雄性生殖细胞发育和成熟的中心要求。 潜在的MIWI切割mRNA片段的鉴定PIWI蛋白的切片活性是通过“乒乓”机制和转座子转录后沉默来进行pRNA扩增所必需的。 利用来自两个对照成人睾丸的5‘-种族分裂片段库(米维+/−)和MIWI切片器活性缺失突变体(米维−/海德)小鼠我们选择了一些片段，这些片段与RefSeq mRNAs的感觉链完全匹配，并将这些片段视为潜在的MIWI切割产物。 为了确保所有选择的片段都来自于mRNAs，我们只包含了与小鼠基因组中唯一的位点相对应的片段。与野生型成年小鼠睾丸miWI相关的piRNAs库，我们注意到潜在的pRNA结合位点与mRNA片段子集之间的位置关系。 如图所示Psma 8, {“type”：“等号-核苷酸”，“atts”：{“text”：“BC 026590”，“Term_id”：“22382113”，“Term_Text”：“BC 026590”}}BC 026590和Mdc 1，推测的切割位点似乎与潜在的piRNA结合位点重叠，其切割位置恰好位于匹配的piRNAs 5‘端的10 nt处。 piRNA介导的小鼠睾丸mRNA切割事件上述潜在的MIWI/piRNA切割mRNA片段的例子促使我们询问这种情况在小鼠睾丸中有多常见。为此，我们系统地筛选了在小鼠睾丸中表达的pRNAs的潜在mRNA靶点。 考虑到iRNA和mrna之间的完美或近乎完美的碱基配对是miWI有效切割的必要条件。我们首先寻找碱基配对，在第2至21位的pRNA与mRNA之间的错配不到3次(见下面针对pRNA的碱基配对规则)。 接下来，我们研究了在5‘-种族文库中发现的5’端mRNA片段附近潜在的pRNA结合位点的分布情况。与之前的观察一致，MIWI在10 nt位置将目标从目标pRNAs的5‘端处切割出来。 我们观察到5‘端位于切割位点下游10 nt位置的匹配的pRNAs有很强的富集。图2A)。相反，从米维−/海德小鼠睾丸(图2B)，提示MIWI的切片活性对这类mRNA片段的产生是必不可少的。 如果我们只计算mRNA片段而不是靶向的pRNAs，我们就得到了类似的结果。补充资料，图S2A)。 我们共鉴定了1,878个pna：mrna相互作用，其基础是在第10位米维+/−小鼠睾丸(图2A, 表1和补充资料，表S1)，共涉及1295个非冗余的piRNAs和193个mRNA片段。我们认为这193个位于169个特定蛋白编码基因中的片段是潜在的pRNA靶点. MIWI介导的剪贴器对mRNA切割调控的分析为了为miWI/piRNA介导的小鼠睾丸mRNA切割调控提供实验依据，我们进行了miwi剪贴器seq，正如我们最近描述的。以确定MIWI与RNA之间的物理相互作用。 考虑到我们先前的研究结果，我们发现大量的MIWI及其相关的pRNAs存在于圆形精子细胞中。我们对从成年小鼠睾丸中分离出来的圆形精子细胞进行了MIWI剪辑-seq。补充资料，图S4A)。 我们发现∼有4800万的读取数据可以被映射到老鼠的基因组上。考虑长度为25-33nt的阅读为piRNAs，较长的读(序列为36 nt)为MIWI限制的目标RNA(图3A我们发现，共有1,700万个∼对应于pRNAs，∼1,000万读对应于MIWI目标。 重要的是，虽然大多数miWI结合的piRNAs和目标来源于各种含有重复序列的转录本和长时间的非编码RNAs(IncRNAs)，但很大一部分读子也被映射到蛋白质编码基因的感觉链(图3B). PRNA靶位点的特征我们进一步分析了193个预测的piRNA靶位点(补充资料，表S1)，并发现大部分这些位点(∼75%)被多个pna(图5A)。 有趣的是，我们发现超过70%的潜在目标位点位于3‘-UTRs(图5B尽管HAT 3‘-UTR序列仅占5’-RACE文库中所有∼片段的30%，提示pRNA靶位点优先位于目标mRNA的3‘-UTRs中。 讨论综上所述，本研究结合计算与实验相结合的方法，通过分析序列互补、靶位点位置以及与目标位点相匹配的piRNA读取，推导出pRNA：mRNA相互作用的规律。 尽管我们所推导的规则还有待进一步完善，但我们的数据表明，pRNA：mrna之间的相互作用要求 (1)piRNA与mRNAs之间存在最小的∼16-nt连续互补， (2)在pIRNA的5‘端有严格的碱基配对， (3)在随后的20个nt序列中，<3错配； (4)将3’-UTRs保守为首选的pIRNA靶位点； (5)在针对特定mRNAs的pRNAs中的第1和第10位富集U和A残基。 鉴于数以百万计的piRNA在小鼠睾丸中表达，其在沉默转座子中的作用已经得到了充分的证实。 因此，在未来的研究中，确定pRNA机制的哪一部分致力于保护基因组不受转座子的影响，以及哪一部分参与蛋白质编码基因的调控，以及这两个过程在哺乳动物雄性生殖细胞发育的不同阶段相互协调，将具有重要意义。 欢迎微信关注【非编码RNA研究园地】，我们致力于及时发布医学科研前沿进展，帮助医务工作者开拓思路，从专业角度解答课题基金及SCI相关问题，助力学术成果转化。 |
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