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一. 研究背景DNA内的致病性体细胞错义突变聚合酶ε(polymerase epsilon，POLE)核酸外切酶结构域在子宫内膜癌(EC)的新型分子分类中定义了超突变肿瘤的重要亚型，具有
因此，已提出“ POLE-超突变” EC(POLEmut EC)作为一种独特的临床实体，可以在存在致病性POLE核酸外切酶结构域突变(EDM)的情况下进行诊断。 对于五个最常见的POLE突变（P286R，V411L，S297F，A456P和S459F），已确认了致病性(指肿瘤超突变的原因)，但是，其他分类由于POLE变体的使用频率较低，因此目前具有挑战性。随着用于分子EC分类的POLE测序正迅速进入临床实践，这已成为一个紧迫的问题。 综上，该分类器的临床实施要求对POLE突变的致病性进行系统评估。为了解决这个问题，作者检查了基础变化，肿瘤突变负担(TMB)，DNA微卫星不稳定性(MSI)状态，POLE变异频率，82个EC的六种计算机工具的结果以及来自癌症基因组图谱(TCGA)的全外显子测序。其中41个具有五个已知的致病性POLE核酸外切酶结构域突变(EDM)之一，并显示出特征性的基因组变化。 MSI-H与POLE EDM的罕见结合使我们研究了这种关联的临床意义。 二. 分析流程三. 结果解读1. 数据处理(1) 数据提取TCGA EC同类群组为了分析EC TCGA队列的基本变化比例(n = 530，530个TCGA EC的COSMIC特征，从mSignatureDB获取)，作者从GDC下载了MAF文件，并使用了编码变体(单核苷酸取代(SNV)，包括同义突变和插入或缺失)的体细胞作为突变计数。为了估计TMB，作者又从GDAC数据库获取38 Mb作为外显子组大小的估计。 (2) EC和泛癌中体细胞POLE突变的复发我们在完整的TCGA GDC目录和COSMIC中搜索了每个体细胞POLE突变。注释其在所有癌症类型(泛癌)中的复发并且仅在EC内复发。复发性突变定义为在COSMIC和TCGA数据库中两个或多个癌症样本中存在的突变(两个数据库中的病例仅计数一次)。如果仅发现一次突变，则认为该突变是非复发性的。 (3) In silico预测工具为了评估体细胞POLE突变的功能状态，我们使用了六个广泛使用的计算机工具中：SIFT，PROVEAN，PolyPhen-2，PANTHER，SNAP2和元预测变量REVEL。 (4) EC中报告了体细胞POLE突变，TCGA中未发现(5) DNA错配修复缺陷微卫星标记不稳定，POLE核酸外切酶结构域突变的子宫内膜癌队列从十个参与研究机构的2,988个分子学分析的EC的队列研究中，鉴定出了伴随MMRd和体细胞POLE EDM的肿瘤，并进行了临床随访, 这些肿瘤与五种肿瘤同时伴有微卫星标记不稳定性和2013 TCGA EC队列的POLE EDM合并进行生存分析。 (6) 统计分析使用χ2统计或Fisher精确检验比较名义变量，使用Mann-Whitney检验比较序数变量。所有的统计检验都是双向的，统计学意义在p <0.05时被接受。我们生成了无复发生存期(RFS)和总体生存期(OS)的Kaplan-Meier曲线，并通过对数秩检验检验了差异。中位随访是通过反向Kaplan-Meier方法估算的。 2. 证实了不同的POLE突变在致病性上不同，提出了对其可靠性的估计来确保准确的患者分类的需求为了阐明哪种基因组改变最能定义病原体的POLE突变(即寻找很可能导致肿瘤超突变的原因)，以及得到在完整的TCGA队列中具有体细胞POLE突变的子宫内膜癌的基因组特征，作者使用了TCGA分析的530 EC数据，其中包括82个具有体细胞POLE突变的肿瘤，其中59个(72％)位于核酸外切酶域内，23个(28％)位于核酸外切酶域外。59个核酸外切酶结构域突变包含21个独特变体。根据先前的报告将其中最常见的五种(P286R，21例；V411L，13例；S297F，3例；A456P，2例；S459F，2例)归为致病菌。本研究将已发表的上述突变微店位点称为“热点”(表1)。 在TCGA和COSMIC数据库中，每个POLE突变的位置(即核酸外切酶结构域对非核酸外切酶结构域)的位置，其在子宫内膜癌，泛癌和泛癌中的复发或非复发状态，以及在所有情况下的基因组特征(图1)。 从先前的报道已知，这五个热点POLE突变与升高的TMB有较好的相关性(该突变超过100 mut / Mb：通常使用在大多数肿瘤中定义为超突变)。 这些分析证实具有五个体细胞热点POLE EDM之一的EC具有不同于MSI-H和微卫星序列稳定(MSS) POLE野生型EC的特征基因组序列改变。这些基因组改变在具有非热点POLE EDM的病例中存在差异，并且在核酸外切酶结构域以外具有POLE突变的EC中并不常见。POLE突变的基因组相关性在其位置上的变化可以通过携带这些突变的癌症中MSI的患病率变化以及带有两种缺陷的肿瘤的基因组结构差异来反映(表2)。 3. 建立体细胞POLE突变的致病性评分系统根据上述初步分析，作者接下来使用TCGA WES数据开发评分系统，依据表1和图1中数据，以热点POLE突变为真集(truth set)评估POLE突变的致病性，定义为与特征性超突变表型相关的可能性。 以TMB和C> A，T> G，C> G和indel比例为这些致病突变的最有区别的基因组变化，并在先前的工作基础上，开发一种实用的评分系统，考虑到非核酸外切酶结构域突变与与超突变表型相关的基因组改变的关联不频繁，作者选择关注核酸外切酶结构域中的突变。 作者考虑了COSMIC或TCGA数据库中EC中是否存在POLE变异，因为复发突变更可能是致病的，这是肿瘤超突变的原因。依据χ2统计肿瘤得分，依据Fisher精确检验肿瘤具有复发突变，并根据这些结果，将“复发”纳入最终评分系统，并将其称为“ POLE致病性评分”(POLE-score)，是基于五个热点POLE突变的突变类型比例和TMB以及变异复发的诊断评分系统(图2)。 为了定义致病性的临界值，我们在TCGA队列中对热点POLE突变，非热点POLE EDM和对照POLE野生型EC(MSS和MSI-H)应用了POLE-score。38/41具有热点POLE EDM的EC的POLE得分≥5分(图1)。其余三个均带有V411L突变的肿瘤得分为4分。相比之下，在非热点POLE EDM的18种肿瘤得分普遍偏低。 根据这些数据，作者使用≥4分的POLE评分来定义EC中POLE突变的致病性。当采用该临界值时，TCGA中的48个EC被归类为具有致病性POLE EDM(所有41例均具有热点突变，而7例均具有非热点变异)；包含11个独特的突变，所有这些突变均在TCGA / COSMIC中复发(表3)。基于不存在与超突变表型相关的基因组改变，POLE得分≤2的EC被归类为非致病性POLE EDM。评分为3的POLE EDM（A465V，L424V，T278M和A428T）被归类为不确定意义。 4. 得到体细胞POLE突变的致病性，微卫星标记不稳定性与临床结果之间的关系根据之前报道，EC中POLE突变和MMRd / MSI的共存，以及POLE突变位置引起的POLE突变的发生率，引起了重要的问题，即决定肿瘤表型和临床结局的主要因素是哪些。为了进一步对此进行研究，作者使用POLE评分将TCGA病例分为大于4的预测的致病性和非致病性POLE突变。得到结论EC中与MSI共存的POLE突变更有可能是非核酸外切酶，非致病性突变，尽管并非普遍如此。 为了调查POLE核酸外切酶域突变型EC伴有MMRd的临床结果，作者从3,236个EC的汇总分析中确定了30例此类患者(表4)。 如下图，该亚组的5年无复发生存率(RFS)为83.2％，5年总生存率(OS)为80.9％(图3)，似乎与之前报道的POLE核酸外切酶域突变EC的5年RFS和OS形成了鲜明对比。 尽管结合MMRd / MSI和POLE EDM的肿瘤的临床行为可能会因后者的致病性而有所不同，但这种差异在统计学上并不显着，这可能是由于功效不足/病例数少，因此无法确定目前该亚组的预后尚可肯定。 MMRd-POLE mut EC的RFS(图3A)和OS(图3B)的Kaplan–Meier生存曲线。带有致病性POLE EDM的MMRd-POLEmut EC的RFS和OS(表3中存在突变)与所有其他肿瘤MMRd-POLEmut(图3C和D)。 5. 在没有外显子组或基因组测序的情况下估算体细胞POLE突变的致病性在临床实践中，体细胞突变谱分析通常是通过针对性的靶点测序来完成，而不是目前的WES / WGS方法。 为了确定在临床实践中将致病性归因于POLE突变的问题的程度，作者从TCGA以外的EC队列中鉴定出具有体细胞POLE突变的296/3840肿瘤(表5)。如上所述，这些工具的阴性预测值大于阳性预测值，表明良性预测应具有更大的权重，并且前者是非致病性突变，而后者应被视为具有不确定的致病性。对于此类情况，可以优先考虑进行更全面的排序，例如WES可提供足够的数据来确定其POLE分数。 6. 在临床实践中对体细胞POLE突变进行分类的建议基于以上分析，作者开发了一种实用的工具，可在临床实践中对具有体细胞POLE突变的EC进行分类(表6)，建议使用(表6A)可提供POLE分数，或(表6B)不使用POLE分数对具有POLE突变的EC进行分类。图注：如果仅进行肿瘤测序，则检测L424V变体应促使考虑种系检测。
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