【原】筛完miRNA以后要怎样补分析？

Identification and functional analysis of specific MS risk miRNAs and their target genes特异性MS风险miRNA及其靶基因的鉴定与功能分析

一、研究背景

        多发性硬化症（MS）是一种慢性自身免疫性疾病，与中枢神经系统（CNS）白质脱髓鞘有关。目前，多发性硬化症的诊断主要依靠其临床表现和MRI图像，所以难免会出现诊断上的错误。因此，我们需要在血液中寻找可靠的生物标志物。已有研究表明miRNAs与MS之间存在着相关性，miRNAs在人体液体中也呈现出很高的稳定性，miRNAs在血液中的可检测性也比在细胞中的可检测性高得多，所以，细胞外miRNAs有望作为MS的潜在诊断和预后生物标志物。

二、分析流程

三、结果解读

1. 筛选文献

        首先，需要筛选包含miRNA的MS的文章。作者于是从PubMed、Web of Science和Google Scholar数据库中查阅了104篇文章来筛选与MS有关的miRNA，最终确定了9篇符合条件的文章（表1）。

        筛选标准为：（以后大家筛选文献也可以效仿这个标准来筛）

• 样本来自人类血浆或血清（所需要的样本来源的组织）

• 病例组和对照组的样本量应分别不低于10个（样本量要尽可能高）

• 排除了报道MS患者接受药物逻辑治疗的研究（排除其他因素干扰）

• miRNA表达前驱必须经过PCR实验验证（实验要严谨）

表1. 符合条件的9篇文章

2. 从文献中获取与MS有关的miRNA及其在人类染色体上的位置

        然后需要从已得到的文献中筛选miRNA，筛选的标准为：

• 排除重复的miRNA

• 排除在这些文献中表达不一致的miRNA，筛选在所有文献中表达上调和下调都一致的miRNA

        作者从符合上述标准的文献中筛选出28个差异表达的miRNA（表2）。作者发现：

• let-7家族成员（let-7a、let-7d和let-7f）紧密位于人类chr 9中，并且在MS中具有相同的表达模式(上调)；

• miR-24-3p、miR-23a、miR150和miR-181c均位于人19号染色体上，并且miR-24-3p和miR-23a在染色体上的位置非常靠近。

表2. 与MS有关的miRNA及其在人类染色体上的位置

3. 通过GO分析获取miRNA下游的靶基因并得到其功能

        接下来需要寻找miRNA的靶基因并探究其功能。

        作者利用miRSystem和miRTarbase数据库找到了数千个靶基因。接着进行GO富集分析，发现889个基因富集在已知的免疫相关通路，于是把这些基因作为探索集基因。此外，作者还列举了GO分析的结果（图1）：

• 细胞成分(CC)方面，200多种免疫相关基因编码的蛋白主要位于膜封闭腔和细胞器腔。其他位于核腔、胞内细胞器腔、胞液和核质。

• 分子功能(MF)方面，大多数基因在转录中起调节作用(约250个基因)。

        此外，作者还将这些基因与MS相关的miRNAs的匹配结果列举了出来（图2），发现：

• miR-181a拥有最多的MS相关基因（176个），说明miR-181a是MS相关基因表达的关键调控因子。

• miR-223、miR-128-3p、miR-24-3p和let-7a的下游靶基因数目也比较多，值得进一步深入研究。

图1. GO分析结果，细胞成分（左）和分子功能（右）

图2. 通过靶基因数目的多少来判断miRNA在预测MS中的重要性

4. KEGG富集分析确定与MS有关的通路

        作者使用KEGG富集分析，确定了60条与MS相关的重要通路（表3）。其中，HSA04010(MAPK信号通路)、HSA04722(神经营养素信号通路)、HSA04660(T细胞受体信号通路)、HSA04210(细胞凋亡通路)、HSA04012(ErbB信号通路)、HSA04662(B细胞受体信号通路)和HSA04664(Fc epsilon RI信号通路)为前7条MS风险通路。

表3. KEGG富集分析结果

5. 确定枢纽基因并构建PPI网络

        作者使用Cytoscape软件构建了通过KEGG富集分析筛选到的7个MS通路与这些通路的富集基因之间的网络（图3）。结果作者通过该网络确定了3个枢纽基因：

• PIK3R2：受miR-30e和miR-93调控

• PIK3R1：受miR-128-3p和miR-155调控

• PIK3CA：受miR-155调控

图3. MS风险通路和富集基因之间的网络（绿色节点代表7条MS风险通路，蓝色节点代表各信号级联中的靶基因，红色节点代表枢纽基因）

        作者使用STRING数据库和上面已经筛选得到的889个基因建立PPI网络，并使用Cytoscape软件将结果可视化（图4）：网络一共有37个节点，其中中心性最高的枢纽基因是MAPK8。

图4. PPI网络（蓝色节点代表富集基因，红色节点代表枢纽基因）

        根据上面构建的MS风险通路-基因网络以及PPI网络分析的结果综合得到MS的枢纽基因是PIK3R2、 PIK3R1、PIK3CA和MAPK8。

6. 使用高通量转录组数据集对靶基因进行评估

        最后一步就是对上述实验所得结果的验证（至关重要）。

        作者从GEO数据集中选择了6组高通量转录组数据集，使用limma包对差异表达基因DEGs进行筛选，并将MS相关基因（这里指的是上面那富集到889个免疫相关通路的基因）与每组的差异表达基因进行了比较（表4），发现枢纽基因PIK3CA在GSE21942(fold change= 0.81，p = 0.0035)和GSE117935(fold change= 1.29，p = 0.019)中差异表达，而PIK3R1、PIK3R2和MAPK8无统计学意义。

表4. 6个用于验证的转录组数据集

小结

       文章到这里已经介绍完了，作者首先在网络上筛选与MS有关的文献，并从中找到与MS有关的miRNA；接着作者进行GO分析来寻找miRNA下游的免疫相关基因；然后作者利用KEGG富集分析和PPI网络分析筛选枢纽基因并利用GEO数据库对结果进行验证。