【进阶篇】高效液相色谱法的原理、构造、故障

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高效液相色谱法（HPLC）

是60年代末以经典液相色谱法为基础，

引入了气相色谱的理论与实验方法，

流动相用高压泵输送，

采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法 。

与气相色谱法相比具有：

适用范围广，

样品预处理简单，

分离效率高，

流动相选择范围广，

检测方法多为非破坏性的，

流出组分可回收等优点。

正相色谱（normal phase）：

流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:氨基柱、氰基柱、硅胶柱。

常用流动相为极性小的有机溶剂。

反相色谱（reversed phase）：

流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有：ODS( C18)， C8， C2。

常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。

离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。

离子对色谱（ion pair chromatography）——将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度，改善分离效果，达到分离目的。

常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类

                         烷基磺酸盐——用于碱类

离子色谱法（ ion chromatography ）

离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱，可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。

 

空间排斥色谱（steric exclusion ）

也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。

凝胶渗透——以有机溶剂为流动相

凝胶过滤——以水溶液为流动相

对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。

 

胶束色谱(micellar chromatography)

表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒）。

以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。

因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（pseudo phase chromatography）。

 

手性色谱(chiral chromatography)

用于分离手性药物对映体的一种有效技术，可分为直接法和间接法两类：

直接法：

手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)

手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)

间接法：

手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)

日常维护和常见色谱故障

溶剂及样品的准备

过滤溶剂的目的湿防止固体颗粒损伤仪器或柱头；未经过滤的溶剂或者溶剂瓶中生长微生物，都会降低溶剂入口过滤头的寿命，并影响泵的性能，一般要求两天过滤一次。      

注意：过滤水相或有机相应该选用不同的滤膜

－－聚四氟乙烯几乎可以过滤所有的溶剂、酸和碱

－－尼龙66可以和大多数的有机物、水相容，

但是建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMF

－－纤维素滤膜用于水相

 

溶剂脱气的方法

－－氦气脱气

－－真空脱气

－－回流加热脱气

－－超身脱气（最为常用）

避免使用的溶剂

－－卤化物碱金属溶液及相应的酸溶液

－－高浓度的无机酸如硝酸、硫酸

－－能形成自由基的试剂及其混合物

－－四氯化碳和异丙醇或THF混合液

－－含强络合剂的溶液    

 

色谱柱的平衡

为了确保分析结果的再现性，对于反相柱应使用5～10倍柱体积的流动相平衡色谱柱。注意：新装到系统的色谱柱需要进行初始化。先断开柱子和检测器间的管路，用流动相将色谱柱中的原有流动相或气泡移出色谱柱，然后再将色谱柱和检测器间的管路接好。

  

保护色谱柱

过滤所有的溶剂和样品

使用保护柱

仪器使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液

柱子不使用时，两端密封

注意柱子使用的pH范围

不要高压冲洗柱子，不要高温下过长时间的使用硅胶键合相

 

常见色谱故障－基线噪音

可能的原因

－检测池脏

－检测器灯能量下降

－由泵引起的脉冲

－检测器上的温度效应

－检测池中有气泡通过

 

常见色谱故障－基线漂移

可能原因

－梯度洗脱引起

－流动相脏

－柱子没平衡

－系统中污染物溢出

RID检测器温度不稳定

 

常见色谱故障－鬼峰

鬼峰－没有进样就有色谱峰出现

原因－流动相脏，尤其是水相

 

常见色谱故障－双峰

柱头塌陷或柱床运动

泵头过滤芯部分堵塞

组分共流出

 

常见色谱故障－压力过高

可能原因

－柱子进口过滤芯被污染

Purge阀过滤芯被污染

色谱柱被污染

连接管路堵塞

进样器旋转密封阀被堵塞

进样针或者针座被堵塞

可用分段法来检查哪一段发生堵塞

  

常见色谱故障－压力过低

溶剂进口过滤芯被堵

连接管路泄漏或其他备件泄漏

溶剂或流速的改变

主动阀失灵

四元比例阀失灵

单向出口阀失灵

柱子失效（固定相流失）

 

常见色谱故障－压力波动

可能原因：

－溶剂进口过滤芯堵塞

－溶剂未脱气

－泵的密封圈老化

－出口单向阀失效

－主动阀失效

－最常见的原因失泵内有七宝