（三）小麦持久多抗基因Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2

Lr46是从CIMMYT小麦品种Pavon 76中发现的抗叶锈病基因，该品种自1976年在墨西哥应用以来一直保持着良好慢叶锈病抗性，是第二个正式命名的小麦慢叶锈病基因(Singh et al., 1998)。之后陆续发现该基因还兼抗条锈病(Yr29, William et al., 2003)、白粉病(Pm39, Lillemo et al., 2008)、秆锈病(Sr58, Singh et al., 2013)，并且具有叶片干尖的特点(Ltn2, Rosewarne et al., 2006)。因此，Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2是继Lr34/Yr18/Sr57/Pm38和Lr67/Yr46/Sr55/Pm46之后的又一个持久多抗性基因(图1)。

图1 小麦持久多抗基因Lr34、Lr67、Lr46和Lr68(Huerta-Espino et al., 2020)

1.    Lr46基因的发现与分布

Singh等(1998)在CIMMYT利用Pavon 76分别与两个感叶锈病品种Jupateco73S和Avocet S构建杂交组合，利用Jupateco 73S × Pavon 76杂交组合F₂代衍生的118个F₃和F₅家系和Avocet S × Pavon 76杂交组合F₂代衍生的148个F₃和146个F₅家系在1991、1992-1993、1995-1996和1996-1997多个生长季分别用TBD/TM和MCJ/SP小种进行田间接种成株期抗性鉴定。结果显示，小麦品种Pavon 76成株期叶锈病严重度为5-10%，感病品种Jupateco 73S和Avocet S的严重度为80-100%，而Jupateco 73S × Pavon 76杂交组合F₁植株成株期叶锈病严重度在30%左右，说明Pavon 76的叶锈病成株抗性遗传呈部分显性。Pavon 76在成熟期叶锈病严重度可达30-40%，叶片上的孢子按抗病性分级标准可划分为中感-感病，具有中等和大型的孢子堆，但没有叶片褪绿和坏死；而感病品种Jupateco 73S和Avocet S叶片上则有大型的孢子堆，没有叶片褪绿和坏死。表明Pavon 76与叶锈病菌具有亲和反应，表现为慢锈性或部分抗性。

两个杂交组合的F₅代遗传群体叶锈病严重度分布呈连续变异，对F₃和F₅代群体的抗性遗传分析结果显示Pavon 76中可能携带两个叶锈病成株期抗性基因，并且具有加性效应。Singh等(1998)将Pavon 76与成株期高感叶锈病的小麦品种Lalbahahur的21个单体系杂交进行抗病基因单体定位，发现Lalbahadur 1B单体与Pavon 76杂交后代具有叶锈病成株抗性，对杂交后代中单体株自交收获的F₂和F₃代群体进行鉴定，发现1B单体杂交后代呈现纯合抗病和分离，进而将Pavon 76中的一个成株抗性基因定位于1B染色体，命名为Lr46。

William等(2003)研究了Pavon 76的成株期条锈病抗性，发现其条锈病严重度介于5% - 15%，而感病对照Avocet S的严重度为90% - 100%。利用Avocet S×Pavon 76杂种后代群体进行多年追踪，发现成株期叶锈病抗性和成株期条锈病抗性高度相关，相关系数达0.71 - 0.85。使用分子标记进行BSA分析，构建了Lr46/Yr29位点的遗传图谱，将Lr46/Yr29位点于1BL染色体，并获得了相关性较高的AFLP分子标记PstAAGMseCTA-1。之后Lillemo等(2008)还发现Lr46/Yr29位点兼具有成株期白粉病抗性，并正式将其命名为Pm39。随后，Singh等(2013)又发现Lr46/Yr29/Pm38位点还有具有成株期秆锈病抗性，并正式命名为Sr58。此外，Rosewarne等(2006)发现Lr46/Yr29基因伴有叶尖坏死症状，将其正式命名为Ltn2。因此，最初发现的Lr46基因，实际上也是一个抗多种小麦叶部病害基因。

  除了小麦品种Pavon 76外，CIMMYT小麦Saar (Lillemo et al., 2008)和Pastor (Rosewarne et al., 2012)、阿根廷小麦Klein Chajá (Cobo et al., 2018)、以色列小麦Oligoculm (Suenaga et al., 2003)、肯尼亚小麦Keny Kongoni (Calvo-Salazar et al., 2015)和Kenya Nyangumi (Singh et al., 2019)、印度小麦Kundan(Ren et al., 2017)等品种中也发现了Lr46位点。自Herrera-Foessel等(2011)首次报道硬粒小麦中也携带Lr46以来，Lan等(2019)和Li等(2020)也在硬粒小麦中发现了Lr46基因，并且Li等(2020)利用连锁分子标记csLV46G22检测到Lr46/Yr29在硬粒小麦中高频分布，占比高达83%。  

2. Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2的精细定位

    自从Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2持久多抗位点被发现以来，国内外多个课题组开展了分子标记定位研究，这里重点介绍美国加州大学戴维斯分校Dubcovsky课题组的工作。Cobo等(2018)利用两个阿根廷小麦品种Klein Proteo和Klein Chajá构建了96个重组自交系(RIL)，对条锈病成株期抗性进行定位，检测到4个QTL位点：QYr.ucw-1BL、QYr.ucw-2BS，QYr.ucw-3D和QYr.ucw-4DL，其中，来源于Klein Chajá的QYr.ucw-1BL可解释31.0% - 32.8%的条锈病抗性遗传变异，且与Yr29处于同一个染色体区段(图2)。

图2 QYr.ucw-1BL与其他成株抗性位点的关系（Cobo et al., 2018）

为了精细定位QYr.ucw-1BL，Cobo等(2019)利用分别只含QYr.ucw-1BL和QYr.ucw-4DL的重组自交系RIL55和RIL66杂交，构建作图群体(图3)。先使用QYr.ucw-1BL两侧的分子标记IWA695和IWA7892，从121个F₂单株中筛选到50个涉及重组事件的单株。然后采用90K芯片检测两个亲本的SNP，开发TaqMan标记，对这些重组单株进行基因分型，将QYr.ucw-1BL定位在分子标记IWB34935和IWB72918之间，两者与QYr.ucw-1BL的距离分别为0.5 cM和1.6 cM(图4a，4b)。

图3 QYr.ucw-1BL精细定位策略(Cobo et al., 2019)

随后，使用IWB34935和IWB72918这两个分子标记从2359个F₄单株(来源于杂合的F₃植株)中筛选到124个涉及重组的单株。此时采用外显子捕获技术检测亲本的SNP，开发KASP标记，对重组单株进行基因分型，将QYr.ucw-1BL定位于分子标记ucw.k34(0.02 cM)和ucw.k18(0.04 cM)之间，该区域在中国春基因组中的跨度为115 kb，只含1个完整的基因TraesCS1B01G454100，编码受体类蛋白激酶(RLK)(图4c，4d)。

图4 QYr.ucw-1BL的精细定位(Cobo et al., 2019)

    作者把目标区放大，对分子标记ucw.k31和csLV46G22之间的332 kb区间进行分析。中国春1BL染色体的该基因组区段课注释出14个基因(表1)，包括6个Kinase基因，3个葡聚糖内切葡萄糖苷酶(glucan endo-1,3-beta-glucosidase)基因，1个分选蛋白(Sorting nexin)基因，1个F-box基因，1个蔗糖转运蛋白(sugar transporter)基因、1个Zinc Finger和1个WRKY类转录因子基因，其中大部分的基因功能都与抗病性相关，为Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2基因的克隆和候选基因确定带来了难度。

表1 Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2持久抗病基因定位区间基因注释

3. Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2在我国小麦育种中的利用

 目前的研究认为Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2基因有两个来源。一个是来源于南美乌拉圭的小麦地方品种Americano 25e(Kolmer et al., 2015)，另一个是古老的印度品种(Lan et al., 2015; Ponce-Molina et al., 2018)。我国小麦育种家培育的许多个小麦品种中都在Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2这一基因区段定位出成株期抗多种叶部病害的QTL位点，表明其可能含有该持久多抗基因，说明该基因很早就被我国小麦育种家认识到其抗病性，并加以利用。如河南科技学院小麦中心茹振钢教授团队育成的百农64(豫麦54，1998年通过河南省审定)高抗当时的条锈菌生理小种22-31号、叶锈菌2号、4号、6号、8号、34号、44号小种和白粉病、叶枯病以及土传花叶病，是多抗、广适、优质、高产、稳产小麦新品种，当时已经在黄淮麦区亩产稳定在500公斤，是河南省第8次更新换代的主导品种，累计推广7500万亩，获河南省科技进步二等奖。中国农业科学院作物科学研究所何中虎和夏先春团队利用百农64 × 京双16构建的179个DH系群体，于2009-2010和2010-2011年度在甘肃天水进行成株期条锈病抗性鉴定，于2010-2011年度在河北保定和河南周口进行成株期叶锈病抗性鉴定，利用BSA法进行QTL分析，在1BL染色体上鉴定到来源于百农64的兼抗叶锈病和白粉病的主效位点QLr.caas-1BL/QPm.caas-1BL(图5，Ren et al., 2012)，该QTL的定位区间与Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2基因所在染色体区间一致。

图5 小麦品种百农64成株期抗叶锈病和白粉病QTL定位(Ren et al., 2012)

    河北农业大学李在峰课题组利用四川农科院培育的小麦品系SW8588与感叶锈病对照品种Thatcher构建的RIL群体，通过55K SNP芯片构建遗传连锁图谱，在1BL染色体上也定位到位于Lr46/Yr29基因区间的成株期抗叶锈病QTL位点(Zhang et al. 2019)；在另一个福豫3号/郑州5389构建的RIL群体中，也检测到位于Lr46/Yr29基因区间的成株期抗叶锈病和条锈病QTL位点(Gebrewahid et al., 2020)。电子科技大学杨足君课题组与四川农科院杨武云和杨恩年课题组合作，利用小麦品种川麦42与川麦55构建的RIL群体，通过SLAF策略构建遗传连锁图谱，在1BL染色体上也定位到来源于川麦42的位于Lr46/Yr29基因区间的成株期抗条锈病QTL位点(Yang et al. 2019)。在这些可能含有Lr46/Yr29基因的品种中，SW8588和川麦42都是四川省农科院培育的小麦品种(系),福豫3号是从漯麦4号(豫麦57号)中系选的品种，尤其是百农64、川麦42和漯麦4号都是具有较大推广面积的品种，说明Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2这一持久多抗基因已经在我国有较为广泛的利用。山东省农业科学院作物研究所李玮等(2020)利用Lr46的分子标记检测了367份国内外小麦品种资源，发现其中携带Lr46基因的材料有129份，比例非常高。但因为Lr46基因尚未克隆，缺乏精准的功能标记，他们怀疑检测结果中Lr46基因假阳性比例较高。

    Cobo等(2019)还评价了在育种品系中累积多个持久多抗基因的效应，他们分析当累加位于1BL的Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2基因和位于4DL的Lr67/Yr46/Sr55/Pm46时，1BL的Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2基因效应显著高于4DL的Lr67/Yr46/Sr55/Pm46基因，二者具有一定的加性效应(图6)，但抗病效果并未显著提高。但该研究仅针对一个特定的遗传群体进行了检测，还需要更多的研究加以评价。CIMMYT的Ravi Singh团队考察了聚合多个持久多抗基因的抗病效应。他们发现累加Lr34/Yr18/Sr57和Lr68基因比单独一个基因可以显著降低田间成株期叶锈病程度，累加Sr2/Yr30/Lr27和Lr34/Yr18/Sr57极显著提高了对条锈病、叶锈病和秆锈病的田间成株期抗性(Randhawa et al., 2018)。

    聚合多个抗病基因无疑会提高抗性的程度和持久性，但抗病基因表达防御反应是消耗寄主自身能量的过程，在目前已经有了较多的抗病基因(包括功能标记)及其载体品系可供选择的情况下，利用分子标记辅助选择聚合不同的抗病基因时，究竟需要累加多少个抗病基因才能实现持久和广谱的抗性，而又尽量减少对产量和品质等农艺性状的影响？如Lr34/Yr18/Sr57/Pm38/Ltn1和Lr46/Yr29/Sr58/Pm39/Ltn2都表现叶片干尖，累加这两个基因在一起会不会导致叶片干尖更严重？还是在一或两个持久多抗基因的基础上累加一些主效的抗病基因效果更好？印度人的研究指出导致叶片干尖最严重的是Lr67基因，平均为叶片面积的7.811%；Lr46基因次之，为7.348%；Lr34基因最低，为6.47%；同时还发现这3个基因同时存在的情况下并未导致叶片干尖程度的增加(LTN% 4.7055%),但这3个基因都降低千粒重和小区产量(Mishra et al., 2018)。在综合考虑产量和品质等农艺性状的情况下，如何更好地综合利用持久抗性(水平抗性)和垂直抗性基因进行种质创新和新品种选育还需要进一步的研究和实践。

图6 持久多抗基因Lr46/Yr29和Lr67/Yr46的累加效应

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