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药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上是一种蛋白质工程分子修饰方法。药物的聚乙二醇修饰可分为两个阶段。
第一阶段的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(<20000)。常用的修饰剂有单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SC)等,通过酯键或三嗪环将聚乙二醇与药物分子偶联,这种非特异性的不稳定连接方式使得一个药物分子经常连接数个聚乙二醇分子。但第一代聚乙二醇修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。
以应用相对分子质量高(>20000)聚乙二醇修饰剂为特征的第二阶段的修饰技术具有连接稳定、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳定性、更高的产品均一性和纯度。
但总得说来,蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一,给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点,科研人员开发了多种定点修饰的策略和方法。
有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C端则是一种有效的修饰策略。一般选用mPEG-酰肼或mPEG-胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。mPEG-酰肼是近年来开发的又一种可与羧基特异性结合的修饰剂。
与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性PEG衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋。
白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因工程手段引入巯基反应位点。这一方法不但能够实现高度选择性修饰,而且能够减少蛋白生物活性的丧失,并降低免疫原性。 目前可用于巯基修饰的mPEGs包括mPEG-马来酰亚胺、mPEG-邻吡啶-二硫醚、mPEG-乙烯基砜及mPEG-碘乙酰胺等。其中mPEG-马来酰亚胺制备简单,应用较多。PEG-邻吡啶-二硫醚与蛋白质偶联形成的S—S键,在生理条件下可缓慢水解,释放出天然蛋白质,有利于活性的恢复,但修饰率低。PEG-乙烯基砜在pH7-9范围内可选择性的与巯基反应,当pH较高时则与氨基交联。PEG-碘乙酰胺的优势在于经强酸水解后,可释放出半胱氨酸衍生物,易于鉴定。
对蛋白中含有的二硫键进行PEG定点修饰分为2个步骤:首先利用温和的还原剂使二硫键还原释放两个硫氢基;第二步通过PEG修饰剂的双烷基化反应重建二硫键,从而完成PEG的定点修饰。在修饰蛋白过程中不会出现蛋白的不可逆变性,而且二硫键还原后蛋白仍维持其三级结构,PEG选择性的修饰两个硫基,PEG的立体屏障作用确保1个二硫键只结合1分子PEG。但是二硫键PEG修饰可能会由于PEG的屏蔽作用,降低蛋白的生物活性。Veronese等利用变性剂盐酸胍(3mol/L)使蛋白部分变性,高级结构打开,但不使用还原剂以保护二硫键,在非折叠状态下完成PEG修饰后,通过透析或凝胶过滤色谱的方法去除变性剂,使蛋白重新正确折叠恢复生物活性
通常只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行PEG化学修饰。Deiters等开发了一种定点修饰非极性氨基酸苯丙氨酸的方法,首先用叠氮化物通过亲核取代反应修饰蛋白质中的苯丙氨酸生成对位叠氮化苯丙氨酸,再用炔烃衍生的PEG-酰胺修饰剂修饰苯丙氨酸,发生环化加成反应形成稳定的连接体,从而完成对蛋白的定点修饰。另外,通过基因重组在蛋白质中引入含叠氮基团的氨基酸残基,再与特定PEG修饰剂偶联形成稳定的定点单修饰产物。Cazalis通过基因工程方法在血栓调节蛋白(Thrombomodulin)的C端引入叠氮蛋氨酸,与mPEG2三芳基膦(mPEG2triarylphosphine)修饰剂生成稳定的单修饰物,尽管该方法比较复杂,但至少给我们提供了一个新的PEG修饰蛋白的思路
此类PEG定点修饰的原理是:首先用葡萄糖氧化酶或高磺酸钠氧化糖类残基产生具有反应活性的醛基,这些醛基可与mPEG2肼衍生物反应生成腙或与mPEG2胺衍生物反应生成可逆的Schiff碱。用硼氢甲腈钠可将腙还原为更稳定的烷基肼化物,而Schiff碱可以还原为仲胺。相对于mPEG-胺衍生物修饰,PEG-肼衍生物修饰不会形成交联聚合体,更适合于糖基的修饰,最有代表性的mPEG2肼衍生物是mPEG2酰肼(hydrazide2mPEG)。酰肼基团极低的pKa值使得酰肼基团在酸性环境下(pH4.5～5.0)中仍可以和羧基结合,而蛋白质中的氨基在该条件下由于发生质子化而不能与羧基反应,从而可实现选择性定位修饰。
由于蛋白种类多样和结构复杂,往往会使得PEG修饰反应特异性不强,反应条件要通过大量试验优化。如果能够利用计算机技术对蛋白质晶体结构表面性质进行理论计算和分析,确定可能的反应位点和基团,并根据被修饰基团与修饰剂的结构特点设计合适的连接物,这样不但可以减少PEG修饰的盲目性,而且能够提高研究效率。胡远东等利用InsightⅡ分子模拟软件包(BiosymInc.,SanDiego,CA)对牛血红蛋白晶体(bHb)进行了结构分析和分子模拟,计算了蛋白表面24个可进行PEG修饰的Lys残基及其主要原子的溶剂可及表面积,确定了其中可以进行修饰的13个Lys残基(溶剂可及表面积>0.4nm2),并进一步设计了具有双功能基团的小分子化合物环氧乙烷基活化PEG作为连接体。结果表明,PEG修饰的bHb的携氧能力和免疫原性等生物学指标均达到预期结果。
PEG衍生试剂材料的介绍：
西安瑞禧生物科技有限公司提供聚乙二醇衍生试剂其中PEG可修饰的基团包括以下：
PEG-OH 羟基
PEG-NHS 活化脂
PEG-SG 琥珀酰亚胺戊二酸酯 Succinimidyl Glutarate
PEG-MAL 马来酰亚胺
PEG-SH 巯基
PEG-Silane 硅烷
PEG-NH2 氨基
PEG-Biotin 生物素
PEG-SS 琥珀酰亚胺琥珀酸酯 Succinimidyl Succinate
PEG-GAS
PEG-ALD 丙醛
PEG-NPC 对硝基苯碳酸酯
PEG-OPSS 邻二硫吡啶
PEG-Hydrazide 酰井
PEG-Acrylate 甲氧基-聚乙二醇-丙烯酸酯
PEG-Azide 叠氮
PEG-Alkyne 炔基
PEG-CHO 醛基
PEG-DSPE 二硬脂酸磷脂酰乙醇胺
PEG-FITC 异硫氰酸荧光素
PEG-RB 罗丹明B
PEG-Chloride 氯化物
PEG-COOH 羧基
PEG-EPO
PEG-SVA 琥珀酰亚胺戊酸酯
PEG-SPA 琥珀酰亚胺丙酸酸酯
PEG-DBCO
PEG-LA 硫辛酸
PEG-胆固醇
PEG-Folic Acid 叶酸
mPEG L-Lysine 赖氨酸
mPEG Cysteine 半胱氨酸
mPEG Glutathione 谷胱甘肽
mPEG Aspartic Acid 天（门）冬氨酸
mPEG Glutamic Acid
Polylysine PEG
Dextran PEG
BSA PEG Conjugate
以上资料来自小编YQ2021.1
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