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肾癌肿瘤微环境图谱鉴定和研究 ccRCC与免疫治疗 ■晚期肾癌治疗药物发展历程 细胞因子时代 靶向治疗时代 免疫联合治疗时代 FDA批准的进展期肾癌治疗药物 1992：高剂量IL-2干扰素 2005：贝伐单抗联合IFN-α、索拉非尼、舒尼替尼 2006：替西罗莫司、依维莫司、索拉非尼 2007：培唑帕尼、舒尼替尼 2009：阿昔替尼 2013：依维莫司 2015：阿昔替尼、卡瑞替尼、乐伐替尼联合依维莫司 2018：纳武单抗联合伊匹单抗 2019：阿特珠单抗+贝伐单抗、阿瓦鲁单抗+阿昔替尼、帕博利珠单抗+阿昔替尼 CFDA批准的进展期肾癌治疗药物 ●肾癌从抗血管生成靶向治疗时代进入免疫联合治疗时代； ●免疫联合治疗逐渐成为晚期肾癌一线治疗的主流，尤其是PD-1联合抗血管生成药物，ORR提高至55%以上，无论PD-L1表达高低均有获益 ccRCC与免疫治疗 ●2019 ASCO转移性或不可切除性ccRCC的一线治疗 ●2019 ASCO转移性或不可切除性ccRCC的二线治疗 ●2019 ASCO转移性或不可切除性ccRCC的三线治疗 ■美国FDA已经批准三项PD1/L1单抗联合免疫治疗用于晚期肾癌的一线治疗 肾癌肿瘤微环境的认识尤为重要 世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的 ●传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息 ●单细胞研究，探索 ccRCC肿瘤免疫微环境，是肿瘤基础研究和临床个性化治疗的重要方向 ●单细胞测序数据：21个样本(12个肿瘤样本和9个对照样本) ●TCGA数据库中的ccRCC(TCGA KIRC，533例肿瘤样本和72例正常样本 ●ccRCC肿瘤微环境 细胞图谱 ●24550个细胞，7786个细胞正常组织，16764个细胞来源于肿瘤组织 ●随后通过cell marker数据库对其进行注释，最后筛选到了15种细胞类型（肿瘤细胞、9种免疫细胞及5种非免疫细胞） ●为了揭示瘤内异质性，又针对这15类型细胞进一步细分，共分选出39种细胞亚型 ccRCC肿瘤微环境 细胞图谱-Marker ●ccRCC肿瘤微环境中CD8+T细胞趋向耗竭 ·5108个CD8+T细胞分为了四种细胞簇亚型，其中cluster2（normal），cluster1，2，3（tumor） ·抑制性免疫检查点在cluster4中上调，这些数据表明cluster4细胞在TME中趋向耗竭HAVCR2（TIM3） ·LAG3和 HAVCR2在大多数肿瘤浸润CD8+T细胞中高表达（组织芯片验证免疫检查点表达） ●CD8+T cluster4耗竭型T细胞； ●LAG3和 HAVCR2（TIM3）在大多数ccRCC肿瘤浸润性CD8+T细胞中高表达； ●LAG3和 HAVCR2（TIM3）可能是ccRCC免疫治疗的较好靶点。 ccRCC肿瘤微环境中CD8+T细胞趋向耗竭 拟时序分析·CD8+cluster1 ·CD8+cluster2 *CD8+cluster3 *CD8+cluster4 ●CD8+T逐步向耗竭性T细胞转化 ●在分化轨迹的末端出现了代表耗竭的T细胞簇，T细胞衰竭免疫检查点倾向于上调，而增效检查点倾向于下调 ●metascape富集分析显示，组蛋白修饰、泛素介导的蛋白水解和细胞粘附途径在衰竭的CD8+T细胞中高度富集 ●细胞因子的产生和T细胞的活化发生在ccRCC的早期 ccRCC肿瘤微环境中CD8+T细胞趋向耗竭 SCENIC分析CD8+T细胞转录因子的变化 EOMES调节的基因参与调节T细胞“终端”分化的TF；IRF2是免疫抑制相关的TF NFAT家族不依赖AP-1功能，促进CD8+T细胞的耗竭的TF SCENIC分析发现，转录因子ECOMES，STAT3 、HIVEP和NFAT家族的4个成员在衰竭的CD8+T细胞中被显著激活，而AP-1（JUN、FOS、FOSB）功能被抑制 ccRCC肿瘤微环境中CD8+T细胞趋向耗竭 ●CD8+T细胞在ccRCC的早期被激活，持续抗原刺激后，活化的CD8+T细胞逐步趋向耗竭； ●CD8+T细胞耗竭中，DNA甲基化在这一过程中起重要作用； ●除了PD-1，CTLA-4免疫检查点外，LAG3和TIM3可能是ccRCC免疫治疗的较好免疫治疗靶点； ●鉴定出肿瘤组织来源的CD8+T细胞 Cluster4属于耗竭型T细胞
巨噬细胞在ccRCC肿瘤微环境中占重要位置且趋向M极化 ●CellphoneDB（细胞通讯）分析潜在的受体-配体对并构建相互作用网络，发现巨噬细胞与其他细胞类型的互作作用对最多，巨噬细胞是ccRCC肿瘤微 ●具有M2极化的标记物（CD68/CD163/TREM2/TAMs/VEGFA）在cluster1中均高表达 ●scRNA-seq分析发现，TREM2仅在cluster1中存在； ●TCGA-KIRC测序数据分析TREM2与M2极化标记物之间的相关性，结果发现相关系数均
巨噬细胞在ccRCC肿瘤微环境中占重要位置且趋向M极化 ●免疫检查点的分析和验证，发现CD274（PD-L1）和PDCD1LG2（PD-L2），CD80/86（CTLA4 配体）在cluster1中高表达 ●这一证据证明了cluster1巨噬细胞的免疫抑制特性增强 ●GSVA分析结果发现cluster1中的基因在补体和干扰素（IFN）通路中显著上调，炎症通路下调。 ●cluster1为M2巨噬细胞类群，且具有促进肾透
巨噬细胞在ccRCC肿瘤微环境 ●巨噬细胞在ccRCC肿瘤微环境中占重要位置； ●鉴定出肿瘤组织来源的巨噬细胞Cluster1属于M2-TAM，促进ccRCC恶化和进展； ●免疫检查点PD-L1和PD-L2在cluster1中的表达
成纤维细胞在ccRCC肿瘤微环境中显著富集 ●大多数成纤维细胞来自肿瘤组织 ●FABP5几乎只在成纤维细胞中表达，CEBPB还与脂质代谢有关 ●异常的脂质代谢不仅可能发生在癌细胞中，也可能发生在肿瘤相关成纤维
肿瘤来源的内皮细胞参与 ccRCC的免疫抑制浸润 |
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