写在前面因为我个人的原因，一说这个研究方向的内容就会引发出一些情绪波动，当时发布预告的时候还吐槽了一通，但是让我没想到的是，我的一番吐槽竟然会有这么多人来鼓励我、帮助我，在此对这些朋友致以最崇高的敬意！！ 写完了之后，才感觉这种感谢的说法听起来好像怪怪得，有一种奇异的画面感😂，不过感谢的心情是真实的😄！！ 下面会给出本次分享PPT的全部内容，这个PPT是两年前制作的，内容主要包括3部分，第一部分是抗生素抗性基因的相关背景，第二部分是我所参与发表的3篇文章，第三部分是我在当时想要进行的一些抗生素抗性基因研究的内容。 因为是两年前制作的，所有并没有包含最新的研究进展，最后一部分提出的研究思路也是基于当时的研究情况所提出的，在现在的条件下进行这些方面的研究，肯定还需要进一步的优化和完善。 我个人以后估计不会在去碰抗生素抗性基因这个方向了，所以如果各位老师对最后一部分介绍的研究方向感兴趣，尽管拿去参考，也可以加我的微信，大家一起探讨一下优化的方向。 公众号里会以图片 文字的形式给出PPT以及我讲述这个PPT的讲稿，这里也提供pdf版本的完整PPT内容，请在公众号后来回复“ARGs”获取下载方式。 ⚠️PPT中大部分的图来自于已发表的文章，但是也有一部分是我自己制作的素材，为了预防这些素材被不正确的传播而带来的可能麻烦，请需要原始PPT素材的朋友添加我的微信，并说明使用的具体情况，pdf版本部分页面打了水印，请见谅。 在发布预告的时候还立了第二个小目标，如果当时的文章再看达到100，会更新PPT并录制讲解视频，不过目前看来应该是达不到这个目标了。 这里再次立一个小目标，截止2020年4月30号24点之前，如果本篇文章的再看达到了100，那么我将会更新本PPT，添加最新的研究进展以及抗生素抗性基因研究中可能涉及的除高通量测序以外的实验方法！！ PS：再看在文末右下角！！ 第一部分接下来我们正式开始！ 首先介绍为什么要研究抗生素抗性基因？ 要了解这一问题就要先介绍一下什么是抗生素？什么是抗生素抗性？ 1944年，链霉素的发现者Waksman给“抗生素”下的定义是如下： 抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的，具有抑制其它种类微生物生长及活动甚至杀死其它种类微生物性能的化学物质。 20世纪80年代，随着抗肿瘤和抗寄生虫等抗生素的不断发现，这类化合物的作用已经超出了仅仅对微生物的作用范围，因此，一般认为，抗生素的定义应该是在低浓度下有选择地抑制或影响其它种类生物机能的，是微生物生命过程中产生的具有生理活性的次级代谢产物及其衍生物。 微生物对抗生素的抗性可以分4类：
从图中也可以看出抗生素对微生物的作用主要是通过与DNA复制、转录和蛋白质翻译过程中的各种酶或其它分子结合，从而阻碍微生物的正常生理功能。 了解了抗生素和抗生素抗性是什么之后，我们再来看一下抗生素及其抗性的研究历史。 人类对于抗生素的研究主要分为三个阶段：
在进行抗生素抗性基因研究之前，我们首先要知道研究这个东西的目的到底是什么？ 环境中存在着很多中致病微生物，会导致多种人类疾病，而当致病菌中携带了抗生素抗性基因之后，就会导致现在普遍使用的抗生素治疗方法失效，从而对人类健康构成了巨大威胁。 据统计，在美国每年有超过200万人受到抗生素抗性致病菌的感染，并且会造成超过23000人的死亡。 既然抗生素抗性基因的主要威胁就是降低抗生素的治疗效率，那么我们在环境领域研究抗生素抗性基因最重要的目的就应当是限制抗生素抗性基因在致病微生物中的存在。 按照一般污染物质的研究思路，想要控制一个污染物质，首先肯定是要掐断污染源的，那么我们自然想要知道一个问题，就是环境中抗生素抗性基因是从哪来的？ 一项针对25000年前永久冻土的研究中发现，在这么古老的样本中依然检测出了抗生素抗性基因的存在，并且这些检出的抗生素抗性基因与现代发现的抗生素抗性基因十分类似。 这也就证明了抗生素抗性基因是一种自然存在的物质，这其实也很好理解，抗生素抗性基因也是一种基因，说白了就是一段DNA序列，在任何生物中都可能存在。 此外抗生素抗性基因还有一个非常特殊的特性，很多基因虽然现在被认为是抗生素抗性基因，但其实这些基因的本职工作大多并不是抵抗抗生素。 这是由于目前很多抗生素是人造的，在自然界本身是不存在的，而基因是自然界本身存在的东西，很多基因在自然生物中在其本身参与的代谢网络中发挥着本质的工作，只是恰好它能够抵抗某些人造抗生素，而使其成为了抗生素抗性基因，并且由于长时间抗生素的滥用，使得这些基因在自然微生物群落中的丰度越来越高，才造成了抗生素抗性风险问题。 常规意义上说，抗生素抗性问题的起源是来自于抗生素的滥用，比如在医疗、农业、畜牧业、水产养殖中长期的大量使用抗生素，最终导致了抗生素抗性的问题越来越凸显。 道理也很简单，大量抗生素的使用杀死了原本不具有抗性的微生物，那么最终留下来的微生物大多都具有抗生素抗性，也就导致了抗生素的效果明显下降。 一项横跨几十年的研究表明，随着抗生素的发明和大量使用，环境中抗生素抗性基因的丰度呈指数型的上升趋势。 而抗生素使用的限制，也成为了目前针对抗生素抗性问题最常见的解决办法，在没有抗生素压力的情况下，微生物携带的抗生素抗性基因会造成一些额外的生存负担，从而经过一段时间之后微生物群落自然会淘汰掉携带抗生素抗性基因的个体，从而降低整体群落对抗生素的抗性。 针对目前抗生素抗性问题的严重性，全世界都在努力限制抗生素的使用，但是俗话说“上山容易下山难”，想要增加抗生素抗性基因的流行程度只需要使用抗生素这么简单，但是要想让已经广泛传播的抗生素抗性基因恢复到正常水平，单靠限制抗生素的使用可能解决不了问题。 理论上来说，如果我们停止了抗生素的使用，那么受体环境中抗生素抗性基因的水平应该会持续的下降，最终达到一个正常环境应用的水平。 但实际却不是这样，在一项比较早的研究中，研究人员发现，在停止对水产养殖环境使用抗生素之后，其抗生素抗性基因并没有下降，而是一直保持在一个比较高的水平，这就说明了一个问题，在自然环境中，必然存在抗生素以外的因素会影响抗生素抗性基因。 要了解这个问题，我们就要先清楚抗生素抗性基因的传播机制了。 抗生素抗性基因之所以受到这么多的关注，就是因为其具有可移动性，也就是可以从一个微生物转移到另一个微生物，从而使得原本不具有抗生素抗性的微生物能够抵抗抗生素。 这种基因在不同生物之间转移的过程被称作“水平基因转移”。 水平基因转移有3种类型，分别是转化、转导和接合转移。 转化就是环境中位于生物细胞之外的游离DNA直接被细菌吸入，进而整合在其基因组中的过程。 转导是依赖于噬菌体的DNA传递过程，细菌在侵染噬菌体的过程中，会将其DNA注入细菌细胞内，从而有部分DNA有可能整合在细菌的基因组中。 接合转移通过不同微生物表面的接触，在细胞膜表面打开一个通道，使得可移动基因单元，主要是质粒，在不同微生物之间进行传播。 在这三种水平基因转移中，接合转移是抗生素抗性基因传播最主要的方式。 转化和转导的过程比较简单，也比较好理解，对于接合转移的过程要详细介绍一下。 可移动基因单元主要包括质粒、转座子和整合子，而这几种可移动单元在依赖于接合转移的抗生素抗性基因传播过程中是相互关联并具有一定等级的。 最基础的是整合子，负责基因的整合，其首先将抗生素抗性基因连接在其基因盒中。 之后在转座酶的作用下，通过插入序列使整合子整合的基因在染色体和质粒之间发生转移，这种基因的转移是双向的。 最后，通过可移动的质粒，将质粒上携带的基因在不同微生物之间传播。 了解了抗生素抗性基因的传播机制之后，我们在回到抗生素抗性基因的来源问题上。
现在发现的抗生素抗性基因中，有相当一部分的原始功能并不是抗生素抗性，这些基因在原始的宿主中，是其它代谢或调控网络的一部分，发挥着其它的生理功能。 但是这些基因恰好又能够使得微生物抵抗现代的抗生素，因此这部分基因会脱离原有的代谢网络，通过水平基因转移在微生物间传播，发挥抗生素抗性的功能。 那么我们此时就会想到两个问题： 第一，这一部分原本不是抗性基因的基因，是否也同时会被其原本的底物所选择，从而造成其大量的传播？ 第二，能够促进水平基因转移的因素，是否也同时会促进抗生素抗性基因的传播？ 针对这些问题，其实已经有了很多的研究成果，比如说在2006年的时候，就已经发现了重金属可以通过共选择机制，在富集重金属抗性基因的同时间接的选择抗生素抗性基因。
近些年来，针对这些非抗生素类物质影响抗生素抗性基因的研究也是越来越多。
比如由于氧化压力导致细菌细胞膜完整性被破坏、细胞膜通透性增加，导致不同细菌间结合转移的频率增加，从而促进了抗生素抗性基因传播的机制已经在多种物种的研究中被发现，比如说离子液体、金属纳米粒子、消毒剂等等。(PS：这里的文件表老，近年来又发现了其它很多物种具有这种能力) 有了研究的问题之后，我们还需要确定一个研究的体系，不同环境类型中，影响抗生素抗性基因的因素也肯定各不相同，这里总结了一下抗生素抗性基因在环境中传播的可能路径。
第二部分这部分内容主要是之前参与发表的3篇文章，感兴趣朋友可以看看，不感兴趣或者之前看过我文章的朋友就直接跳过吧😊 选择了海洋，准确的说是近岸环境作为研究的对象。
选择海洋环境的原因首先是抗生素抗性基因在海洋中分布非常广泛，可以说在海洋的任意位置均检测到抗生素抗性基因的存在，同时海洋中的抗生素抗性基因具有极高的多样性。 其次，海洋中检测到了大量与人类致病菌携带抗生素抗性基因高度相似的基因单元，同时海洋中含有多种多样的可移动基因单元，为抗生素抗性基因的转移提供了便利的条件。 因此，海洋环境被认为是抗生素抗性基因重要的储存库、自然来源，并且在抗生素抗性基因的传播中发挥着重要的作用。 既然是研究非抗生素类物质对抗生素抗性基因的影响，那必须还要选择一种研究的额靶标物质。
但是在海洋环境中，除了个别的特殊地区，比如污染严重的河口、水产养殖区等地，绝大部分海洋环境中抗生素的含量是非常小的，并不足以定向的选择抗生素抗性基因。 而石油作为海洋中最主要的污染物质，对海洋环境的影响非常大，但是海洋中的石油污染是否会影响抗生素抗性基因的传播，我们却并不清楚。
选择石油类物质作为研究对象，并不是单纯的因为石油是海洋中最常见的污染物质，研究表明，许多的石油类物质降解基因，并不是存在于微生物的染色体中，而是存在于可移动基因单元中，也就是说这些基因可以通过水平转移在微生物间进行传播。 那么也就是说石油类物质是有可能促进细菌间的水平基因转移，从而间接导致抗生素抗性基因传播的。 接下来是具体文章内容的介绍，首先要证明一个问题，就是石油污染是否会对海洋环境中的ARGs产生影响。
最开始的试验是以典型的多环芳烃萘和菲为底物，测定不同浓度的多环芳烃暴漏后的海水中ARGs的丰度变化。 实验选择测定的基因有三个，第一个是抗生素抗性基因水平基因转移的指示基因第一类整合酶基因，另外两个是位于可移动基因单元上的抗生素抗性基因。 结果显示萘和菲对ARGs的影响均存在一定的剂量效应关系，但是两种物质的影响并不相同，萘是浓度越高对ARGs影响越大，菲是浓度越低对ARGs影响越大。 之后选择ARGs变化最明显的10mg/L菲实验组对实验过程中ARGs的变化动力学进行了测定，因为我是不断的向实验体系中补充菲，使体系中菲的浓度基本上维持在10mg/L左右，从结果可以看出，当外界的环境压力稳定时，ARGs的丰度也会较为稳定。 基于这些时间结果，得到了结论，PAHs的暴漏会增加海水中ARGs的丰度，同时持续的PAHs压力对ARGs的维持也起到了重要作用。 之后通过测定的ARGs与第一类整合酶基因intI1丰度的相关性分析，表明了ARGs丰度的提升可能是由第一类整合子介导的。
随后通过一个接合转移的实验，验证了多环芳烃确实会促进由第一类整合子介导的抗生素抗性基因水平基因转移。
以上是第一篇文章的内容，之后的研究从定量PCR的技术转变为了高通量定量PCR与高通通量测序结合，从研究单独的抗生素抗性基因变为了研究微生物群落整体的抗生素抗性组。 虽然说水平基因转移是抗生素抗性基因传播的主要机制，也是威胁最大的机制，但是在现实环境中，水平基因转移发生的频率还是比较低的，而细菌自身的复制增殖对抗生素抗性基因的影响可能会明显的高于水平基因转移。
这也就是目前很多文章中都会得出的一个结论，细菌群落结构与抗生素抗性组之间具有显著的相关性。
那么其实也就可以说能影响细菌群落结构的因素就有可能影响抗生素抗性基因的传播。 基于这个问题，我们又把目光从海洋环境转到的水产养殖环境，回头再说一下前面提到的停止使用抗生素，但是抗生素抗性基因并没有下降的研究结果，这个研究就是针对的水产养殖环境。
水产养殖中如果排除掉抗生素滥用的问题，可能最主要的环境问题就是饵料的残留，导致营养物质富集，而这些物质恰恰是影响微生物群落结构的主要因素。 通过筛选，我们将目光集中在了水产养殖常见的一种饵料成分—-鱼粉的身上。
首先通过测定发现鱼粉中本身就含有很多的抗生素抗性基因，可能会是水产养殖环境中抗生素抗性基因的一种外部来源。
之后通过实验室建立微宇宙体系，研究了鱼粉对养殖环境抗生素抗性组的影响，这个研究使用的是高通量qPCR技术，就是朱永官老师开发的技术，大家不要在意这个PPT里的图，这个图就是个示意图，实际该技术测定的ARGs种类要比图上显示的多很多，能够达到300种以上。
结果显示，鱼粉的添加确实会增加海水养殖环境沉积物中的抗生素抗性基因和可移动基因单元的丰度。
进一步的分析表明，鱼粉添加导致抗生素抗性基因丰度提升主要是由于细菌群落组成变化所致，其对抗生素抗性组变化的贡献要远高于其它环境因子和可移动基因单元介导的水平基因转移。
说完了养殖池内部的问题，我们再来看看养殖池外部，水产养殖的过程中会向周围环境排放很多的废水，这同样可能会影响受体环境的抗生素抗性组。 我们在东营近海养殖区的一个排水沟中采集了一系列沉积物样品，并采集了黄河三角洲保护区的沉积物样品作为非海水养殖环境的对照样品。
首先测定了这些样品的营养物质和重金属的含量，这部分数据在后面的分析中用到，在这就不详细介绍了。 这个工作是使用QIAGEN公司的抗生素抗性基因芯片，也是一种好通量qPCR技术。
该图是样品中抗生素抗性基因种类的柱状图，从图中可以看到，海水养殖区域样品含有的抗生素抗性基因种类显著高于非海水养殖样品，说明海水养殖活动会导致养殖区域沉积物中抗生素抗性基因多样性的增加。
这张图表示的是样品中抗生素抗性基因的丰度，相比于非海水养殖样品，海水养殖区域中抗生素抗性基因的丰度至少提高了3倍以上，有的样品甚至提高了几十倍，说明海水养殖活动会导致养殖区域中抗生素抗性基因丰度的上升。
之后应用各样品中单独抗生素抗性基因的丰度进行了一个热图聚类分析，得到几点结论： 1、非海水养殖环境单独聚为一类，与海水养殖区域样品差别很大，再次说明海水养殖活动会影响养殖区域内的抗生素抗性基因； 2、在收到海水影响较大的样品中，大部分抗生素抗性基因的丰度下降十分明显，说明海水稀释可以消除海水养殖活动带来的大部分抗生素抗性基因； 3、虽然大部分抗生素抗性基因被海水消除，但是也有个别抗生素抗性基因不受海水稀释的影响，说明海水养殖废物如果不经过处理直接排放进入海洋还是会造成一定的抗生素抗性基因危害。 之后我们通过普氏分析和Mantel test评估了微生物群落结构变化对抗生素抗性基因变化的贡献，结果显示微生物群落结构并不是抗生素抗性基因变化明显的驱动力。
做到这里我们发现，我们对抗生素抗性基因的主要影响机制都进行了分析，但是并没有发现一个在海水养殖环境中起主要作用的机制，我们就怀疑海水养殖中抗生素抗性基因的变化可能是多种机制共同作用的结果，因此我们将所有的影响因素一并与抗生素抗性基因进行了pRDA分析，评估不同因素对抗生素抗性基因变化的解释比例，结果和我们预想的一样，不同因素对抗生素抗性基因变化的解释比例相差不大，说明海水养殖环境中抗生素抗性基因的变化是一个多因素协同作用的结果。 到这第二部分就介绍完了。 第三部分第三部分主要是我之前想过的几个想法，但是这些想法虽然想了，由于个人能力和经费的问题一直都没有成型，而且这几个想法靠我一个人也不可能完成，这里就分享给大家，如果有感兴趣的老师想要去做这几个点，可以拿去参考参考。 不过想法都是3年前的了，现在要做肯定需要进行优化，感兴趣的老师也可以加我微信一起探讨一下。 首先是如何建立一个比较全面的抗生素抗性基因数据分析流程。 这个想法肯定是有很多老师再做的，我这也就是提个想法，搭一个大概的框架出来，做的好的老师别来怼我啊😂 虽然是抗生素抗性基因研究，但其实涉及的内容不只是抗生素抗性基因，至少还需要包括与抗生素抗性基因相关的其它抗性基因。 另外由于水平基因转移的问题，研究抗生素抗性基因必然无法离开可移动基因单元。 抗生素抗性基因最主要的问题就是对于人类健康的风险，也就是致病菌携带抗生素抗性基因之后，抗生素治疗失效的问题，那么微生物的致病性肯定也是必不可少。 最后就是要归结到最核心的问题了，环境中抗生素抗性基因再多，如果进入不到人类或动物体内，那也就只能是风险，而不是实际的威胁，那么在抗生素抗性基因研究中，如果能够估计其向人类共生微生物转移的可能性，那应该是非常有意义的。
这里只是给出了一个大概的数据分析的框架，至于不同的数据到底怎么整合，就需要各位去细细的琢磨了，另外目前针对抗生素抗性基因数据分析的工具发展也是很快，这里面提到的一些分析工具也已经过时了。 想要评估抗生素抗性基因传播的可能性，除了在高通量数据分析方面做文章之外，还有一种更直接的方式，前面讲到了水平基因转移的3种方式，分别是转化、转导和接合转移，而这3种方式又分别对应不同的DNA类型，转化对应游离的胞外DNA、转导对应噬菌体、接合转移对应质粒。
那么我们就可以从一个样本中，分别提取细菌的染色体DNA、胞外的游离DNA、噬菌体的DNA以及质粒DNA，之后分别测定不同类型DNA中抗生素抗性基因的组成结构，进而比较其中的差异，也就能够找到研究的样本中，到底哪些ARGs是真的具有潜在的人类健康风险的，而哪些ARGs又是不需要过分关注的。 我个人的看法是，如果不能够评价一个环境体系中抗生素抗性基因的真实风险，而只是在强调其传播的可能性、潜在的人类健康风险，那所有环境领域中对于抗生素抗性基因的研究都可以说是空中楼阁，说不定哪天就真塌了。 这句话要不要说我其实犹豫了好久，这话说的有点大，我姑妄说之，您姑妄听之。 回到正题，那要是评估一个环境中抗生素抗性基因的真正风险，按照不同的风险等级对抗生素抗性基因有一个明确的区分标准，应该说是很重要的一环。
PS：这想法不是我提出的啊，请看PPT中引用的参考文献。 这里是我之前弄的一个简单的分类模式，想的很不周到，比较简陋，实际应该比这个要复杂的多。 在前几年，这个东西我也没好好的琢磨，因为当时我觉得这东西根本就做不出来，但是随着这两年人工智能和机器学习技术的发展，好像也不是那么遥不可及了。 毕竟现在机器学习在摄影技术上都能有那么强大的功能，用机器学习的方法建立出抗生素抗性基因的风险等级标准应该也是能行的。 如果标准建立了，那么建立一个流程来注释微生物群落中不同风险等级的抗生素抗性基因应该说是水到渠成的事，对于现在的技术来说应该没什么难度。
我这里只是我当时随便写的分析框架，糊弄糊弄人还行，各位别当真！！ 终于把这些字给码完了，可累死我了😭 本文有说的不对的地方，或者说理念和思路不同的地方，请各位老师多多理解！ |
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来自： 商商sutkwkb7dv > 《微生物研究》
