调节谷氨酸受体表达的精神病性miRNA的外显子分泌受抗精神病药的影响

论文：Exosomal secretion of a psychosis-altered miRNA that regulates glutamate receptor expression is affected by antipsychotics（调节谷氨酸受体表达的精神病性miRNA的外显子分泌受抗精神病药的影响）

摘要

小分泌微囊泡，即外胚层，通过其微RNA(MiRNA)的载量影响神经元和胶质功能，使其成为一种新的、有效的细胞间通讯方法。然而，对于外源体分泌的miRNAs在调节谷氨酸受体基因表达中的作用及其与精神分裂症(SCZ)和双相情感障碍(BD)的关系还知之甚少。

应用成熟miRNA谱和定量实时PCR(qRT-PCR)技术对SCZ眶额皮质(OFC)进行了定量PCR(qRT-PCR)分析。NN=26；男性12人，女性14人)，以及未受影响的对照(N=25；21名男性和4名女性)，我们发现miR-223，一种针对谷氨酸受体的外分泌miRNA，在scz和BD患者死亡时有阳性精神病史的OFC中，在成熟miRNA水平上增加，并且与其目标谷氨酸离子致性受体nmda型亚单位2B的表达缺陷成反比关系。

GRIN2B)和谷氨酸离子致性受体AMPA-型亚基2(GRIA 2)。此外，OFC中miR-223水平的变化分别与炎症和GABA能基因表达呈显著正相关和负相关。

此外，miR-223被发现在星形胶质细胞中富集并通过外显子分泌，抗精神病药物被证明以细胞特异性的方式控制其细胞和外生体的定位。此外，在神经元培养中加入星形胶质细胞外小体后，miR-223的表达量显著增加，而miR-223的表达显著减少。

GRIN2B和Gria 2MRNA水平与miR-223表达呈显著负相关。最后，抑制星形胶质细胞miR-223可减少胞外体介导的神经元减少。GRIN2B表情。综上所述，我们的结果表明，控制神经元基因表达的精神病性改变和胶质细胞丰富的miRNA的外体分泌是由抗精神病药调节的。

精神障碍患者OFC中miR-223与谷氨酸受体、GABA能和炎症基因表达的相关性

我们利用SCZ患者死后脑组织的OFC样本(N=29)、屋宇署(NN51]；只包括RNA完整性数(RIN)大于6.5的样本。为了有选择和准确地检测成熟的miRNA转录本，我们采用了NanoString nCountmiRNA谱。

聚焦于OFC中表达最高的200个miRNAs，我们发现了一个失调的SCZ和/或BD miRNAs的子集。采用成熟的miRNA qRT-PCR，以SCZ和BD OFC中未发生改变的两种高表达miRNAs作为正火剂(miR-30d-5p和let-7e，基于miRNA NanoString和qRT-PCR-图)。

1C和表S3-4，并使用单变量一般线性模型(另见“材料和方法”一节)进一步校正rin、脑pH值、死后间隔和冷藏间隔的所有结果，我们首先验证了在miR-223-3p(以下简称miR-223)中，大多数患有scz但没有bd的病例中，miRNA对nmda和ampa(Ampa)受体亚基的增加，从而调节鼠和人的神经元功能。

另一方面，miR-132是一种神经元丰富的miRNA，参与突触可塑性。54]在SCZ中减少。根据以前的报告。此外，miRNA特异性的qRT-PCR证实在BD中miR-330-3p和miR-1260的表达均有中度增加。

虽然这些改变的miRNAs中有一部分是由外显子分泌的，但只有miR-223是大量报道中显示的真正外显子丰富的miRNA，以控制胶质和免疫细胞基因的表达，以应对缺血和神经炎症。

此外，先前的一项研究报告称，奥氮平治疗可显著降低成年小鼠大脑皮层miR-223水平，因此，它也可能对抗精神病药物有反应。

BD精神病患者OFC中miR-223的特异性上调

为了确定死后人口学是否会影响OFC中miR-223的表达，我们研究了18种不同的人口统计学对BD和SCZ OFC中miR-223相对于对照变化的影响。我们没有发现与大多数死后人口统计学的交互作用，包括整体抗精神病治疗的持续时间(在Mg中显示为氟苯嗪当量)。

然而，我们观察到miR-223的变化与酒精使用寿命的变化之间存在负相关(这不能解释在患者和对照组中较高的酒精使用情况下miR-223表达的增加)，并且在死亡时与精神病有显著的正相关。

尽管所有SCZ患者都是精神病阳性者，但在我们的队列中，只有一组患有BD的患者被诊断为接近死亡时间的精神病。因此，我们将BD组分为BD组和无精神病组。我们发现在患有精神病的BD患者中miR-223的表达显著增加，而无精神病的BD患者的表达与对照值相似。

考虑到miR-223和SERPINA 3, GRIN2B, GRIA 2，和ADAR 2在OFC中，我们绘制了它们在两组BD中的表达谱。我们的结果表明，患有精神病的BD患者，而没有精神病的BD患者，在SERPINA 3GRIN2B, GRIA 2，和ADAR 2)。

值得注意的是，NPTX2与miR-223无关的mRNA在BD精神病患者和非精神病患者死亡时均同样减少。我们认为在患有精神病的BD患者中，OFC miR-223和miR-223相关基因的表达变化与SCZ相似。

大鼠神经元同化的星形细胞外显子增加miR-223水平并下调miR-223相关下游靶点

鉴于miR-223在星形胶质细胞中的富集和其在外小体中的丰富程度，我们决定检测星形胶质细胞分泌的exosome是否能调节神经元基因的表达。鉴于外源体除了miRNAs外还可以包括mRNAs，我们在大鼠皮层神经元培养中加入了小鼠星形细胞外显子，以确保受体神经元培养中mRNA表达的任何变化都不是由外源体直接转运的结果。

为此，我们从星形胶质细胞条件培养液中提取了外显子，并与大鼠皮层神经元共同孵育了1~2天，确保在收获大鼠神经元颗粒之前改变培养基并仔细冲洗细胞。

使用成熟的miRNA qRT-PCR引物，优先但不完全检测小鼠miR-223(由于小鼠和大鼠成熟miR-223序列的单核苷酸差异，这些引物有望检测到一些小比例的大鼠miR-223)，并能正常表达-7e。S5a我们首先观察到，与未处理的大鼠培养相比，小鼠星形细胞外体处理的大鼠皮层神经元成熟miR-223的表达增加了两倍。

然而，在其他与外小体相关的miRNAs中，如miR-132(在神经元外小体中富集)和miR-155(在小胶质外小体中富集)，没有观察到任何改变。提示星形胶质细胞胞外小体组分miR-223的富集可使其同化到大鼠神经元培养中。

有趣的是，qRT-PCR分析了大鼠特异性引物的mRNA表达，并将其归一化为18S rRNA(无花果)S5b)显示，Gria 2和GRIN2B，但不是阿达Exosome处理的大鼠皮层神经元中的水平，表明已证实的miR-223靶点优先减少(如图所示)。

为了检查老鼠数量的减少GRIN2B和Gria 2Mrna水平与小鼠miR-223表达增加有关，我们将小鼠miR-223与大鼠和大鼠进行比较。GRIN2B和Gria 2mRNA表达这些比较显示miR-223和GRIN2B(无花果))，与Gria 2 (r=−0.7091，pt，但miR-223与ADAR 1MRNA水平(数据未显示)。

此外，没有观察到Gria 2和GRIN2B和miR-132或miR-155(图1)。S5c-f卡扎菲1MRNA(图1.S5g-h)。以确保星形细胞外体对miR-223的影响GRIN2B和Gria 2在小鼠神经元培养物中也有表达，我们在小鼠皮层神经元培养中加入星形细胞外显子。

我们发现小鼠神经元miR-223水平升高，小鼠神经元GRIN2B mRNA和蛋白表达减少(通过免疫染色)，同时也降低了小鼠神经元GRIN2B的mRNA和蛋白表达。Gria 2MRNA的表达，暗示了物种间的保守效应。为了确定是否需要在星形细胞外体中增加miR-223的表达，以诱导神经元的减少。

GRIN2B和Gria 2通过锁定核酸(LNA)的miRNA抑制剂和提取的外显子，抑制星形胶质细胞miR-223的表达。我们发现抑制星形胶质细胞miR-223足以挽救GRIN2B但不是Gria 2MRNA表达5H，i)。

这些数据表明，外体介导的减少GRIN2B表达是由miR-223介导的，而miR-223则需要额外的外显子miRNAs或mRNAs来调节。Gria 2神经元表达。我们的结论是，小鼠星形细胞外显子miR-223被皮层神经元同化，足以抑制神经元。GRIN2B表情。

讨论

本研究的局限性之一是，我们没有测量来自SCZ的其他主要脑区，如背外侧前额叶皮质(DLPFC)的死后标本中miRNA的表达。然而，在以前的一项研究中，miR-223已被证明是SCZ DLPFC miRNAs中被上调的许多基因之一，暗示了在许多大脑区域改变的可能性。

我们的研究的另一个限制是，我们的NanoString miRNA谱的重大改变不能通过多重比较和人口统计学的校正。然而，使用成熟的miRNA特异性的qRT-PCR，它比任何一种筛选方法都更准确，我们已经验证了多个死后人口统计学校正后屏幕上显示的变化。

此外，由于原代神经元和胶质细胞培养的结构、功能和表达与脑内神经元和星形胶质细胞的结构、功能和表达存在差异，因此不能推断抗精神病药物短期治疗后对小鼠神经元和星形胶质细胞培养物miR-223表达和胞体分泌的差异效应。

此外，还需要在体内进一步研究抗精神病药物对miR-223神经元和胶质细胞及外显子表达的影响。此外，虽然miR-223在人类OFC中的表达与我们队列中抗精神病药物治疗的总时间(以氟苯嗪当量mg表示)没有显著关系，但我们不能自信地认为抗精神病治疗对miR-223的表达没有影响。

事实上，以前在小鼠身上进行的一项研究表明，虽然长期使用氟哌啶醇或氯氮平治疗不影响脑中miR-223的表达，但奥氮平治疗可使脑miR-223水平显著降低。

因此，在接受奥氮平治疗的患者中，SCZ或BD患者死亡时出现精神病的OFC中miR-223表达的明显增加有可能得到改善。今后需要在包含关于抗精神病治疗类型和持续时间的更详细信息的额外队列中开展工作，以充分评估其对OFC中miR-223表达的影响。