PROTAC技术详梳理-总结篇

昵称nujb1wWk 2021-01-23

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▉ 前言

过去十年，药物靶标领域的格局发生了重大变化。尽管传统靶标（比如激酶，G蛋白偶联受体）依然是主方向，但是目前风向也慢慢从传统药物靶标转向更具挑战性的“不可成药”靶标。这些靶标通常包括无酶功能的蛋白质，而这些蛋白占据人体蛋白的80%左右。目前我们所知道的炙手可热的PROTAC技术在克服耐药和靶向不可成药靶点方面展现出了非常大的潜力。本篇药学速览公众号将对PROTAC技术细细剖析，大家多多指点。

目前虽然大分子生物药（单抗，双抗，ADC以及干扰素）研发热潮一浪高过一浪，但是并不代表小分子药物的衰退，恰恰相反，小分子药物因其独特的优势（研发成本相对较低，工艺相对熟练），依然是新药研发的主战场，就拿2020年FDA批准新药来看，一共批准了53个新药，小分子新药就占了38个。PROTAC技术作为一个新兴小分子新药研发的一个利器，何时才能获批第一个新药，让我们拭目以待。作为PROTAC技术的龙头大哥-Arvinas，目前处于临床一期的两个PROTAC药物ARV-110（靶向雄激素受体，治疗前列腺癌）和ARV-471（靶向雌激素受体，治疗乳腺癌），都展现了积极的疗效数据。

▉ PROTAC初登历史舞台

在对药物化学的不断探索过程中，研究者正开发新的策略来靶向疾病驱动蛋白。小分子诱导的蛋白质降解是近年来最值得关注的。控制蛋白质的命运并诱导其降解，使人们不仅可以靶向酶，而且还可以靶向无活性位点或者不可成药的蛋白靶标，比如支架蛋白（scaffolding proteins）的靶标。为此，科学家们发现了利用细胞自身蛋白质降解的方法标记选定目标蛋白质并触发其降解的机制。泛素蛋白酶体系统是该机制的核心，通过蛋白泛素化和随后的蛋白酶体降解来控制蛋白质的命运。PROTACs技术就是利用这种降解机制，使得靶蛋白以蛋白酶体依赖的方式不可逆地被移除，从而治疗疾病，由此可见这其实是一种与传统小分子抑制剂甚至抗体截然不同的作用模式。

PROTAC作用方式的示意图。

PROTAC与目标靶蛋白（POI）和E3连接酶结合形成三元复合物。随后将泛素以E2介导的方式转移到POI上。蛋白酶体识别多泛素化的POI，并在PROTAC释放以参与另一个循环过程时降解

2001年PROTAC首次作为化学生物学方法和新的治疗方法被提出来，经过20年的发展，PROTAC技术已经成熟。早期的PROTAC基于E3连接酶结合的多肽配体分子，但是分子并不是很理想，比如细胞通透性低，不稳定，导致降解效率低下，该技术的突破点之一也在于此，研究人员基于von Hippel Lindau (VHL) E3连接酶开发了更多类药理化性质配体分子，该技术的突破点之二在于阐明了沙利度胺与E3泛素连接酶CRBN作用（沙利度胺重定向E3泛素连接酶CRBN，从而使一些目标蛋白被蛋白酶体降解，也是沙利度胺导致畸行发育的原因）开发了一些可结合CRBN的更加类药的一些小分子。这些发现为2015年报道的针对RIPK2/ERRα和BRD4的PROTAC药物铺平了道路。由于这些突破性的研究显著加速了该领域的发展，学术界对PROTAC诱导的蛋白质降解的兴趣大大增加。从那时起，来自学术界和工业界的许多科研小组就致力于探索该技术的应用。

▉ PROTAC优缺点

PROTAC的优点是不仅可以有效地抑制目标蛋白，还可以快速降解清除。其中一个很值得注意的一点是：只需要催化量的药物，就可以降解细胞内靶标蛋白，故具有较高的安全性、耐药性和广阔的应用前景。

尽管PROTACs已表现出显著的有效性，但是仍有许多不足的地方需要解决。

1. PROTACs分子量一般在700~1200之间，这使得它们的透膜能力与(口服)生物利用度较差，且缺少如适用于小分子药物的“类药五原则”的预测模型，这使得目前大部分的研究仅仅证明了所设计的PROTAC在细胞水平上对靶蛋白降解的有效性与抗增殖活性。

2. 与传统小分子药物不同，目前尚无有效的高通量筛选技术用于快速、大量地评估PROTAC降解POI的能力，只能通过细胞活性筛选或免疫印迹实验等方法实现，这大大降低了开发PROTAC的速度与成功率。

3. 有文献报道，仅仅改变linker的长度或结构就会对PROTAC的降解能力有巨大影响，这或许是由于在泛素化过程中不同的E3酶和POI之间所需的空间距离不同引起的。鉴于目前仍没有POI-Protac-E3酶复合物的晶体结构被解析得到，因此对linker部分的改造缺少指导方向。

4. 发现与E3酶受体蛋白特异性结合的底物具有偶然性，目前报道的PROTAC主要靶向CRBN与VHL，尽管CRBN与VHL是否会发生突变以及突变后是否对PROTAC有影响还是未知，但了解新的E3酶并开发相应的PROTAC具有重要意义，也面临巨大挑战

▉ PROTAC布局与设计

自2013年成立PROTAC公司Arvinas®以来，随后的第二代公司（例如C4Therapeutics®（成立于2015年）和Kymera Therapeutics®（成立于2017年））也开始探索小分子诱导的蛋白降解领域。考虑到近年来人们对这种治疗方法感兴趣，这三个生物技术公司已经与数家大型制药公司进行了数百万美元的合作。很多大型制药公司都开始评估PROTAC技术，他们有的与上述三家生物技术公司合作，有的也建立自己的蛋白质降解平台，例如Novartis®，AstraZeneca®或GSK®。然而，虽然像Arvinas这些第一批研究 PROTACs 的制药公司已经开始产生可口服的有效PROTACs，但对于本领域的其他新手来说，PROTAC的设计和优化并不是一个简单的过程，这一点已变得显而易见。

PROTAC开发时间表（学术界和工业界）

如下图所示，找一个linker将两个配体分子连接起来很简单，也许在体外细胞实验也会降解蛋白，但是分子基本不会有很好的生物利用度，所以避免不了要对E3酶配体、linker和靶标结合剂进行研究和优化。其中linker的结构和长度起着至关重要的作用，因为连接子可以影响总体PROTAC构象和结合方向以及三元复合物的形成。因此，连接子的作用远不止简单地连接两个分子实体。它直接影响PROTAC的活性，选择性和理化性质。为了支持基于结构的优化工作，迄今为止，在没有X射线结构数据的情况下，使用PROTAC三元配合物的X 射线共晶结构和计算方法作为预测三元配合物模型的工具已被成功利用。尽管用于linker设计的化学空间可能很大，但是大多数研究小组更喜欢用烷基或聚乙二醇（PEG）链来确定最佳linker长度。通过选择烷基或PEG的linker，整体理化性质（例如，TPSA （拓扑极性表面积）和cLogP）被相应地修饰。一些刚性结构（例如杂环，炔基）也已用于优化研究中。

图3 PROTAC装配示意图

(A)APROTAC包括蛋白配体、连接体和E3连接酶配体。有代表性的靶蛋白(左)和E3连接酶(右)被明确命名。(B) FAK降解基于VHL的PROTAC的结构。

虽然许多文章中都选择了某些常见蛋白质（例如BRD4或雄激素受体或BTK）作为靶标，但几乎每天都有关于新靶标蛋白质能够被PROTAC介导的降解的报道。对于大多数蛋白质靶标，PROTAC介导的降解效果与传统靶标抑制效果相似，在效果或解决某些耐药机制方面，PROTAC分子优于某些抑制剂。比如，对于PROTAC诱导的靶标黏着斑激酶（FAK，上图）降解能够关闭FAK的信号转导功能，这是小分子Fak抑制剂无法达到的。此外，据报道PROTAC技术清除了额颞叶痴呆（FTD）患者来源的神经元细胞中的Tau蛋白，这些模型将PROTAC的治疗区域扩展到了神经退行性疾病。此类研究证明了PROTAC在药物治疗领域的巨大潜力。令人激动的是，接下来PROTAC诱导的蛋白质降解将解决那些主要的难成药性蛋白靶点引起的疾病。但是许多靶点尚没有发现其合适的配体结合分子，因此筛选和发现一些不可成药靶点的合适的配体分子也将是一个难题。

▉ 总结

迄今为止，蛋白质降解主要集中在肿瘤学领域和神经变性疾病（Tau）或炎症/免疫学（IRAK4和RIP2K）领域，鉴定合适的组织或疾病特异性的E3连接酶也将是很有前景的发展方向。迄今为止取得的初步成果使人们对PROTAC寄予了厚望，这不仅是化学生物学和药物发现工具箱中的附加工具，而且还是成功的治疗方式。但是PROTAC的开发仍然存在许多挑战，还需要克服许多其他障碍，但是路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。下图附上2001-2019年通过PROTAC技术成功降解靶标的总结。