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解螺旋公众号·陪伴你科研的第2177天
要说生命科学领域经久不衰的研究热点，蛋白翻译后修饰绝对算一个。笔者曾经听某位搞质谱的大牛算了这样一笔账，人类大约含有2万出头的基因，对应2万多种蛋白，如果没有种类繁多的蛋白翻译后修饰，很难想象2万多个蛋白可以应付如此动态而复杂的生命活动。
蛋白乙酰化最早发现主要发生在细胞核内的组蛋白上，参与调控基因转录过程。后来，随着蛋白质谱灵敏度的增加，越来越多的非组蛋白被发现也会发生乙酰化修饰。蛋白乙酰化研究开始在代谢、免疫、细胞周期、DNA损伤修复、凋亡、自噬等领域如火如荼地展开。那么对于科研萌新而言，怎么快速地开始蛋白乙酰化修饰研究呢？笔者以一篇2019年末发表在Nature Communications上的自噬领域的研究论文为例简要剖析一下基本的研究思路。为了确定p62是否存在乙酰化修饰，作者首先用了两种去乙酰化酶抑制剂TSA（HDAC家族抑制剂）和NAM（Sirtuin家族抑制剂），确定内源的p62和外源的p62在细胞中均可以发生乙酰化。值得注意的是，只有TSA处理能够提高p62的乙酰化水平，这里就提示p62的去乙酰化过程由HDACs而非Sirtuins介导。这一点在后面的研究中会深入展开。
作者用了多种刺激处理细胞，包括饥饿和MG132（蛋白酶体抑制剂）等，发现只有饥饿能够显著提高p62的乙酰化水平。多说一句，有一位大牛这样讲过，不受调控的蛋白翻译后修饰都是耍流氓，可见找到蛋白翻译后修饰的调控模式多么重要。在哺乳动物细胞中，介导蛋白发生乙酰化修饰的主要包括p300、CBP、PCAF、GCN5和TIP60在内的5种乙酰化转移酶。一般只需要在细胞内进行简单的筛选，如在细胞内分别高表达或者敲除/低以上乙酰转移酶，检测目标蛋白的乙酰化水平，基本就可以确定目标蛋白的乙酰化由哪个乙酰转移酶介导。在这篇文章里，作者发现在细胞内高表达TIP60能够显著提高p62的乙酰化。由于已经确定p62的去乙酰化过程由HDACs介导。因此作者就利用不同的HDAC在细胞内作了简单的筛选，发现在细胞内高表达HDAC6能够显著降低p62的乙酰化水平，也就表明p62的去乙酰化由HDAC6介导。作者进一步利用体外实验证明HDAC6可以直接去乙酰化p62。
一般确定乙酰化位点有两种常用的方法：在细胞内直接纯化目标蛋白进行质谱鉴定；在体外利用纯化的目标蛋白与乙酰转移酶进行体外乙酰化反应，将反应后的目标蛋白进行质谱鉴定。无论哪种方法确定的乙酰化位点，都要通过构建突变体进行最后的确定。乙酰化主要发生在赖氨酸（K）上，一般而言，赖氨酸突变为精氨酸（R）相当于模拟去乙酰化，赖氨酸突变为谷氨酰胺（Q）相当于模拟乙酰化。
确定了乙酰化位点，一般就可以利用构建的模拟乙酰化/去乙酰化突变体研究乙酰化对于目标蛋白功能的影响。在这篇文章中，由于乙酰化位点主要发生在介导p62结合泛素的UBA结构域，因此作者就检测了乙酰化/去乙酰化突变体与泛素的结合情况，以及对UBA结构域形成二聚体的影响。仅仅研究乙酰化修饰对于目标蛋白的影响还不够，一般还需要进一步在细胞水平或者动物水平研究目标蛋白乙酰化的生物学功能。作者因此检测了诱导自噬条件下细胞内泛素化蛋白的降解情况和对细胞活力的影响。
参考文献 You, Z. et al. Requirement for p62 acetylation in the aggregation of ubiquitylated proteins under nutrient stress. Nature Commun, 2019, 10(1):5792. 
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