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发酵是一个复杂的过程，微生物将植物中的糖分转化为乙醇、二氧化碳和其他副产物并发挥了积极作用。发酵不仅能够提高食品的风味和延长货架期，而且能提高生物功能性，如促进新陈代谢、调节酸碱平衡、调节肠胃功能、提高免疫力和营养成分利用率等。发酵一方面通过增加植物性食品中酚类化合物和黄酮类化合物含量来提高其抗氧化活性，另一方面发酵导致植物细胞壁被破坏，释放抗氧化物质。  目前关于猕猴桃发酵相关研究主要集中在纯猕猴桃汁或猕猴桃酒，对于猕猴桃果渣发酵工艺及抗氧化活性和感官分析研究较少。植物性发酵食品在国际市场有广泛的发展空间，相应的产品也逐渐商业化，随着发酵产品的快速发展，发酵产品逐步从饲料扩展到化妆品、药品和食品等行业。虽然已有不少关于猕猴桃发酵工艺研究报道，但是不同猕猴桃品种和地域对于发酵有很大影响，且双正交方法深入探索红阳猕猴桃全果发酵优化工艺尚未有系统报道。因此本研究以新鲜红阳猕猴桃为原料，以酵母和乳酸菌为复合发酵菌种制备猕猴桃酵素。 试验通过双正交方法对其发酵工艺参数进行优化，并在最优发酵工艺条件下研究酵素产品抗氧化能力和感官评价，目的获得具有高品质的红阳猕猴酵素产品并推动当地特色农产品深加工产品开发。   材料与方法 红阳猕猴桃，酵母，果胶酶，纤维素酶，乳酸菌，食品级柠檬酸，去离子水，DPPH、ABTS等，K3[Fe(CN)6]，氨基水杨酸，无水乙醇等试剂（分析纯），LRH-300生化培养箱，，A5176024立式自动压力蒸汽灭菌器，FA2004电子天平，SP-756紫外可见光分光光度计，PAL-BX手持糖度仪，PH-100A笔试酸度计。 实验方法 设计单因素试验，确定酵母、乳酸菌、果胶酶和纤维素酶水平范围并进行第一次正交试验，在其基础上根据相关文献设计初始糖添加量、发酵温度、时间和料液比单因素试验，接着进行第二次正交试验。根据两次正交试验结果确定红阳猕猴桃酵素发酵工艺优化条件。 数据分析 数据首先采用Microsoft Excel软件进行统计，方差分析和显著性分析采用SPSS version16.0统计。每项实验至少进行3次，结果以平均值±标准差表示。 结果与讨论 发酵菌种和酶的添加量单因素试验结果羟基自由基是最具有活性的自由基，对邻近生物分子具有诱导作用并造成重要损害。感官评价能对发酵产品所表现出的感官元素做出直观评价。因此猕猴桃酵素的综合指标由羟基自由基清除率（50%）和感官评价（50%）两个方面组成。  合适的菌种和酶能够有效促进猕猴桃发酵，张晶等发现复合菌发酵能提高野生猕猴酒风味，增加醇类、酯类化合物。彭宁等在猕猴桃酵素工艺条件研究中发现菌种接种量对猕猴桃发酵质量影响最大，因此本实验首先确定发酵菌种和酶添加量，通过单因素实验酵母、乳酸菌、果胶酶和纤维素酶对猕猴桃综合指标的影响。本实验在添加酿酒酵母同时添加乳酸菌共同发酵，一方面酵母为乳酸菌提高可溶性氮化合物，另一方面乳酸菌为酵母生长提供适宜的酸环境。纤维素酶和果胶酶能提高植物中大分子物质的分解，提高发酵效率。已有研究证实猕猴桃的膳食纤维，尤其是非淀粉多糖几乎全部来自植物细胞壁。同样，果胶广泛存在于水果细胞壁，分子量大且不容易水影响发酵效率。通过果胶酶和纤维素酶处理的猕猴桃比非酶处理一方面提高大分子物质释放和分解，另一方面能促进发酵微生物生长活力。 发酵条件单因素试验结果 初始糖添加量为猕猴桃发酵提供必要的碳源，从图 2A看到，随着初始糖添加量的增加，评价指标逐渐升高，当初始糖度添加量超过20%，菌种生长活性受到限制，综合指标开始下降。同样，在发酵环境中，适宜的温度能促进微生物生长以及各种酶类酶解活性，有效的释放和合成活性物质，如黄酮、多酚等。从图2B看到，发酵温度超过36℃，酶活性和微生物生长受到影响。发酵时间是觉得发酵物质量的重要因素，从图2C看到猕猴桃发酵液综合指标随着发酵时间的变化关系，发酵第28d指标最高，因此发酵时间选择范围为21~35d。料液比是影响发酵的关键因素之一，料液比过低抗氧化活性弱，反之发酵成本增高。从图2D看到，料液比达到1:1.7发酵液综合指标达到最高。  发酵菌种和酶添加量正交试验结果 根据酵母、乳酸菌、果胶酶和纤维素酶添加量因素水平表 L9（34），以综合指标为评价标准，进行发酵菌种和酶添加量进行正交试验并对结果进行方方差分析，确定最佳添加量（表1、2）。由表4可知，影响羟基自由基清除率的因素，从主到次为酵母>乳酸菌>果胶酶>纤维素酶；感官方面影响因素为酵母>果胶酶>纤维素酶>乳酸菌。分别以极值最小的因素为误差项进行方差分析（表2），影响羟基自由基清除率因素，酵母与乳酸菌添加量有显著影响；影响感官评价因素，酵母有显著影响。对于综合指标，影响因素为酵母>乳酸菌>纤维素酶>果胶酶，以极值最小果胶酶为误差项，酵母和乳酸菌有显著影响，故确定优化添加量为：酵母、乳酸菌和纤维素酶各2.0%，果胶酶 0.5%。 表1 猕猴桃酵素发酵菌种和酶添加量正交试验结果  表2 猕猴桃酵素发酵菌种和酶添加量正交试验结果方差分析  发酵条件正交试验结果 在菌种和酶添加量实验结果基础上，根据发酵条件单因素试验结果，选取猕猴桃酵素对羟基自由基清除率影响各因素进行正交试验，并对结果进行方差分析，确定最佳发酵条件（表3、4）。由表6可知，影响羟基自由基清除率的因素和感官方面影响因素，从主到次为初始糖度>料液比>发酵时间>发酵温度。分别以极值最小的因素为误差项进行方差分析（表4），影响羟基自由基清除率因素和影响感官评价因素，初始糖添加量、发酵时间和料液比均有显著影响。对于综合指标，影响因素和显著影响结果与各指标一致，即初始糖度>料液比>发酵时间>发酵温度，故确定优化发酵条件为20%初始糖添加量，料液比为1:1.3，36℃发酵35d。 表3 猕猴桃酵素发酵条件正交试验结果  表4 猕猴桃酵素发酵条件正交试验结果方差分析  最优发酵工艺验证试验 按照双正交试验结果最佳发酵条件和工艺进行3次验证实验结果表明（表8），优化后猕猴桃酵素的羟基自由基清除率、感官评价以及综合指标分别为94.33%、76.33 和 85.33，实验结果均高于正交实验测得的结果，表明正交实验获得的红阳猕猴桃酵素在羟基自由基清除率和感官评价方面均得到优化。 表5 猕猴桃发酵工艺验证试验结果  猕猴桃酵素抗氧化效果比较 根据最佳发酵工艺制备猕猴桃发酵工艺优化组，以未添加酵母、乳酸菌、果胶酶和纤维素酶的猕猴桃为对照组。两组猕猴桃均在 20%初始糖添加量和料液1:1.3情况下发酵，且工艺优化组发酵温度为 36℃，对照组为室温发酵。发酵35d 后考察两组羟基自由基清除率、DPPH·和 ABTS·+清除自由基情况。由于猕猴桃皮渣和籽中含有大量色素、多酚及单宁等物质，对于发酵果汁或酒类的感官有影响，因此关于猕猴桃发酵研究大多围绕猕猴桃汁液，全果发酵工艺相对较少。近年来水果皮渣发酵相关研究逐渐成为热点，其原因为带皮发酵可以提高乙酸、总黄酮、总酚等功效成分含量并且赋予发酵物饱满丰富的香味特征。另外，有研究发现尽管带渣发酵中总花色苷含量低于清汁发酵，但带渣发酵能促进皮渣中黄酮等物质溶出，显著提高发酵产品总酚含量和抗氧化活性。从图3看到，经过优化后的猕猴桃酵素羟基自由基清除率、DPPH·和 ABTS·+自由基清除率均增强。与对照组相比，优化发酵后羟基自由基清除率、DPPH·和ABTS·+自由基清除率分别增加了8.69%、11.89%和36.57%，说明酵母、乳酸菌、果胶酶和纤维素酶能够有效的提高猕猴桃发酵效率和活力，且全果发酵能够提高发酵物多酚及单宁含量进而增强抗氧化活性。另外适宜的发酵温度对猕猴桃酵素抗氧化效果起到积极作用。 结论 本试验以羟基自由基清除率（50%）和感官评价（50%）为综合指标，采用双正交实验方法进行猕猴桃发酵工艺优化。本实验首先确定发酵菌种和酶添加量，通过单因素实验酵母、乳酸菌、果胶酶和纤维素酶对猕猴桃综合指标的影响。在此基础上进行正交实验，实验结果表明酵母和乳酸菌为最主要因素，且具有显著性。发酵菌种和酶添加量分别为：2%酵母，2%乳酸菌，0.5%果胶酶和 2%纤维素酶。然后在进一步考察发酵最佳条件，通过单因素实验分析初始糖添加量、发酵温度、发酵时间和料液比对猕猴桃综合指标的影响。正交实验结果表明初始糖添加量、发酵时间和料液比为主要因素，且达到显著程度。最佳发酵工艺为20%初始糖添加量，料液比1:1.3（g/mL），36℃发酵35d。优化后猕猴桃酵素的羟基自由基清除率、感官评价以及综合指标分别为94.33%、76.33和85.33，实验结果均高于正交实验测得的结果。优化发酵后测得红阳猕猴桃酵素抗氧化活性发现，羟基自由基清除率、DPPH·和 ABTS·+自由基清除率分别增加了8.69%、11.89%和 36.57%，优于自然发酵猕猴桃。 本试验以猕猴桃全果进行发酵，通过微生物代谢 获得具有营养价值和保健功能的猕猴桃酵素产品，可 以进一步提升猕猴桃开发利用价值。另外，红阳猕猴桃发酵过程中各阶段不同成分和活性变化还需要进一步研究和分析。 |
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