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导语 今天和大家分享的是2021年2月份发表在Cancer Cell International杂志(IF=4.175)的一篇文章“Identification of a two-gene prognostic model associated with cytolytic activity for colon cancer ”。文章建立了一个基于溶细胞活性（CYT）免疫治疗生物标志物双基因的预后模型（HOXC8和MS4A2）并进行了分析验证，说明该模型可能是对免疫疗法反应的预测因素。 Identification of a two-gene prognostic model associated with cytolytic activity for colon cancer 结肠癌细胞溶解活性相关的双基因预后模型的构建 一、研究背景 在《2018年全球癌症统计》报告中，结肠癌（CC）约占110万新患者，并有551,269例死亡。目前，有许多已确立的CC治疗方法，包括手术切除，生物靶向治疗和化学疗法，但死亡率仍然很高。为了提高患者的生存率，应密切监测其预后以调整治疗方案。，由于标准治疗后预后较差，因此正在探索将免疫治疗作为辅助治疗。研究表明，细胞毒性T细胞，自然杀伤细胞和其他免疫细胞浸润条件可以反映抗肿瘤免疫的强度，并与免疫检查点抑制剂的功效有关。溶细胞活性（CYT）评分被鉴定为一种新的免疫治疗生物标志物，可以表征CD8 +细胞毒性T细胞和巨噬细胞的抗肿瘤免疫活性。因此，有必要探索与CYT水平相关的基因。患有结肠癌和高CYT的患者可能对抗免疫检查点疗法更为敏感，因此，需要探索与CYT相关的基因标记来预测CC的预后。 二、研究思路 三、结果解读 1 数据来源 研究采用了来自公共数据库（TCGA、UCSC和GEO）的几个数据集。为解决TCGA数据库中肿瘤与正常数据之间的不平衡问题，下载了TOIL GTEx和TCGA RNA-seq数据集（包括349个非癌性结肠样本和290个CC样本）和TCGA COAD RNA-seq数据集（包括41个非癌性）以及UCSC（结肠样品和471个CC样品）。临床数据从TCGA资料库中收集，如果发现多个值，则利用RNA表达的平均值。从基因表达综合库（GEO）的存储库中，获得平台GPL96和GSE39582（包括19个正常样本和566个肿瘤样本）的GSE41258（包括54个非癌性样本和186个CC样本）中的基因表达谱矩阵的信息。 2 差异表达CYT相关基因的获得和功能注释 首先，作者通过比较高/低的溶细胞活性CYT样品获得了CYT相关基因（994个上调的基因和424个下调的基因）。随后通过比较正常和肿瘤样品，鉴定了5106个DEG。从上面两个基因的交集中，提取了280个与CYT相关的差异表达基因，其中包括160个下调基因和120个上调基因。此外，对相交的基因进行了GO和KEGG富集分析。GO显示出丰富的独特生物过程，例如炎症反应的调节和免疫效应过程的调节。这些生物学过程都与免疫调节有关。细胞因子-细胞因子受体相互作用是基因最富集的KEGG通路。因此，CYT相关基因与免疫功能和通路密切相关。  图1.与溶细胞活性（CYT）相关的差异表达基因 3 双基因预后模型的开发 使用单变量Cox回归模型，鉴定了与OS显着相关的26个基因，并剔除表现出相反的表达和存活趋势的基因。随后在训练队列（n = 181）中进行了LASSO Cox分析，以进一步缩小基因范围。接下来，使用两个基因构建CYT相关的预后模型：homeobox C8 (HOXC8) 和 membrane spanning 4-domains A2 (MS4A2)。风险评分的计算方法如下：公式=1.52 * HOXC8 + (−2.81) *MS4A2，最佳截止点是-0.319，并在测试集和整套测试中执行类似的步骤。在训练集中，高风险评分的患者的OS短于低风险评分的患者，训练集中0.5年，1年，2年，3年和5年OS的曲线下面积（AUC）值分别为0.820、0.739、0.744、0.676和0.719。  图2.与CCT相关的CYT相关预后模型的K-M生存率，风险评分和与ROC曲线 为了确定模型的稳健性，使用GEO队列（GSE41258）测试了其性能。结果显示，高风险组的患者的OS较低风险组的患者差。其2，3和5年AUC分别为0.894，0.894和0.797。总之，结果证明了该模型在生存预测方面的出色表现。 4 模型中两个基因表达的外部验证和实验验证 为验证CC患者中HOXC8和MS4A2的表达，使用TCGA和GTEx数据集中的数据进行了生物信息学分析。分析表明，与349例正常结肠样品相比，在290个CC样品中HOXC8 mRNA的表达增加，MS4A2的表达下降。结果通过RT-qPCR验证，与配对的正常结肠样品相比，30个CC样品中HOXC8和MS4A2的mRNA水平分别显着上调和下调。通过IHC检测HOXC8和MS4A2的蛋白质水平发现，HOXC8位于肿瘤细胞的细胞质中，而MS4A2在间质细胞中表达。与正常样品相比，CC样品中的HOXC8蛋白表达显着上调，CC样品中的MS4A2表达显着降低。  图3.HOXC8和MS4A2在TCGA + GTEx COAD队列和CC组织中的表达 5 CYT相关预后模型与临床病理特征的关系 为探索风险评分与临床病理特征之间的关系，我们使用TCGA队列分析了风险评分的分布。我们观察到风险评分与肿瘤TNM分期，T分期和M分期显着正相关。  图4.TNM分期与风险评分的关系 在单变量和多变量Cox回归分析中，模型与生存率相关。在其他因素中，模型的中位风险评分最高。这些发现支持该模型是独立的预后因素。  图5.CC中单变量和多变量Cox回归分析的森林图 为了预测CC患者的预后，作者为临床医生提供了一种定量方法。该方法是将年龄，TNM分期和模型的风险评分相结合的列线图。诺模图的C指数为0.804，相对于45度线为理想曲线，校准图上的偏差校正线令人满意。 6 低风险分数与高免疫浸润水平和高细胞毒性相关 高CYT样本的风险分数比低CYT样本的风险分数低，且低风险评分样本的CYT分数较高。TIS在高CYT评分组和低风险评分组中值增加。在低风险评分组中，GO分析显示，白细胞稳态和淋巴细胞增殖是最显着富集的生物学过程，并且KEGG通路的T细胞受体信号传导和细胞因子-细胞因子受体相互作用显着下调。这些数据表明，与高风险评分肿瘤相比，低风险评分肿瘤具有更高的抗肿瘤免疫浸润性。  图6.低和高风险组的免疫细胞浸润 7 双基因预后模型可以预测CC的免疫治疗效果 CTLA4和PD1的免疫检查点阻断疗法已成为治疗各种恶性肿瘤的有效方法。因此分析了免疫检查点与风险评分的关系，发现高CYT评分组和低风险评分组的患者中CD274（PDL1），CTLA4，LAG3，PDCD1（PD1）和TIGIT的表达水平均升高。在GSE39582队列中，也观察到类似的结果。TIDE算法用于估计对免疫检查点封锁的反应。结果表明，具有低风险评分的CC患者的TIDE评分低于具有高风险评分的CC患者，表明低风险评分CC患者对抗免疫检查点疗法有更多希望。此外，低风险组CC患者的表达谱与PDL1反应组的表达谱相关。因此，这些结果表明该模型可以预测CC免疫疗法的益处。  图7.免疫标记预测免疫治疗 四、小结 首先，作者通过CYT差异表达获得了CYT相关的DEGs，建立并验证了两个基因（包括HOXC8和MS4A2）的预后模型。基因集富集分析（GSEA）和其他分析表明，低风险评分肿瘤的免疫浸润和抗肿瘤免疫激活水平高于高风险评分肿瘤,验证了双基因预后模型与T细胞免疫浸润之间的相关性。 |
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