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2020年2月22日，美国冷泉港实验室 (CSHL) David Jackson研究组在Nature Plants发表了题为Enhancing grain-yield-related traits by CRISPR–Cas9 promoter editing of maize CLE genes的论文（刘磊博士为该论文的第一作者）。该研究利用CRISPR/Cas9系统对玉米CLE基因启动子进行编辑，创制了玉米高产等位基因。 
作物产量的遗传改良育种，经历了数次变革。第一代的育种策略，是基于种质源收集、评估和筛选，保留高产优质种质资源进行种植；第二代育种策略标志性事件是杂交育种概念的提出和应用，通过自交系间杂交，获得杂交种，而杂家种由于杂种优势的效应，其产量显著高于双亲，同时化肥杀虫剂等应用，以及矮秆基因在多个作物中的应用，提高了作物的产量；随着生物技术的发展，通过转基因技术、分子标记辅助选择、全基因组选择等，进一步提升了作物的产量等。然而，随着全球人口激增，气候变化对作物产量的不利影响，对基于玉米等作物的生物能源的需求增长等，对作物产量提出了更高的要求。现代玉米的驯化和改良起源于约10,000年前，由玉米野生种大刍草 (Zea mays ssp. Parviglumis) 经过长期的驯化选择，演化为玉米地方品种（landrace），再经过约150年的遗传改良，进而发展出适应性好、籽粒产量高的优良玉米品系。在此过程中玉米对光周期适应性、植株形态、果穗大小、籽粒产量等性状，发生了极为显著的变化（Duvick 2005; Doebley et al 2006）。其中，玉米的产量性状受到强烈的选择，野生种大刍草果穗仅有数十粒籽粒，而现代玉米果穗则多达数百粒，提升玉米单穗的籽粒数可显著提升玉米的产量。
玉米是雌雄异花植物，玉米的果穗（雌穗）为雌花序，发育出雌花，并通过接受雄穗雄花的花粉，受精后最终发育成籽粒。玉米果穗籽粒数目，是在受雌花序发育早期形成和决定的（Vollbrecht and Schmidt 2009）。玉米的雌花花序一般在9-10叶期开始发育，此时位于叶腋处的叶腋分生组织（Axillary Mersitem, AM）转换成花序分生组织（Inflorescence Meristem, IM）（Vollbrecht and Schmidt 2009）。随后，IM上形成多行排列整齐的分生组织，即成对小穗分生组织（Spikelet-Pair Meristem, SPM）。每一个SPM进而分化出两个短分枝的分生组织：小穗分生组织（Spikelet Meristem, SMs）。每个SM最终经历小花分生组织和花器官的分化，授粉后发育成成熟的籽粒（Vollbrecht and Schmidt 2009）。因此，玉米雌穗发育过程中IM持续分化SPM的能力及SPM分化SM的能力，决定了最终玉米果穗上的每穗行数、行粒数等产量性状（Vollbrecht and Schmidt 2009）。因此，提升玉米花序分生组织活性，理论上可增加果穗籽粒数目，提升产量。 玉米花序分生组织（IM）的建成和维系，是玉米花序正常发育的基础。和其他分生组织类似，IM主要发挥两方面作用：通过植物干细胞（Stem cell）的分化起始其他组织器官的发育；通过细胞的分裂进行自身的增殖（Vollbrecht and Schmidt 2009）。在植物中，维持花序分生组织生长和分化的经典途径是CLAVATA-WUSCHEL feedback loop，其中包括在IM中部特异表达的WUSCHEL（WUS）基因，在IM中特异表达的CLAVATA1（CLV1）和CLAVATA2（CLV2），以及负责WUS向CLV1和CLV2进行信号传递的CLAVATA3（CLV3）信号分子（Williams and Fletcher 2005）。拟南芥中WUS基因的产物可促进分生组织的生长及CLV3信号分子的表达，CLV3可以和CLV1-CLV2复合体互作，进一步抑制WUS的表达，因此形成一个动态平衡的负反馈回环通路，维持分生组织的分化活性（Williams and Fletcher 2005），打破此通路平衡的突变体，表现为分生组织过度增殖（Williams and Fletcher 2005）。CLV-WUS通路在植物中相对保守，在玉米中鉴定了拟南芥CLV1、CLV2和CLV3的同源基因突变体thick tassel dwarf1（td1）（Bommert et al 2005）、fasciated ear2（fea2）（Taguchi-Shiobara et al 2001; Bommert et al 2013a）及Zmcle7、Zmfcp1（Rodriguez-Leal et al 2019）。这些突变表型类似，均表现为IM的增大，雄穗雌穗增粗、穗行数增加等表型。然而这些突变体，由于分生组织过度增殖，导致果穗发育异常，因而显著降低产量。美国冷泉港实验室David Jackson研究组利用EMS等技术创制的fea2的弱突变体，可保证果穗正常发育，且提升了分生组织活性，进而数量上提升了穗行数等产量性状，因此通过对这些基因的人为改造，精细优化它们的生物学活性，对优化玉米分生组织活性、提升玉米产量，具有重要的潜在价值。Rodríguez-Leal等人利用CRISPR-Cas基因编辑技术，对番茄的CLV3基因进行调控序列的编辑，获得了可以调控番茄果实大小数量变异的新的等位基因，实现了利用基因组编辑技术对目的基因进行人为设计（Rodríguez-Leal et al 2017）。因此应用基因组编辑技术可以进一步创造优良等位基因资源，快速应用于玉米的遗传改良，在玉米育种中的具有广泛的应用前景（Wolter et al. 2019）。 玉米的CLAVATA3（ZmCLE7和ZmFCP1）是一类短肽信号分子，其将信号传递给CLAVATA1（TD1）、CLAVATA2（FEA2）及FEA3，并通过他们抑制WUSHEL基因的表达，进而形成一个反馈调控的信号通路，精准调控花序分生组织发育。为了获得其弱突变等位基因，该项最新研究探索利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，靶向其启动子区域，获得影响其表达量的弱突变体。针对ZmCLE7和ZmFCP1启动子区域，研究者利用ATAC-seq和MNase-seq等数据进行染色质开放区域（accessible chromatin regions）的分析，同时利用进化分析，预测启动子区域可能的保守的调控位点，并分别设计9个sgRNA，靶向其启动子区域。通过筛选，ZmCLE7和ZmFCP1启动子区域分别筛选到数个大片段的缺失和倒位的编辑事件。这些编辑事件可显著改变基因的表达水平，数个启动子编辑等位基因可使表达量数量水平降低~45% - ~69%。其中ZmCLE7启动子倒位编辑的等位基因，却使得ZmCLE7表达部位扩展到IM内部。通过进一步的表型分析发现，一些启动子缺失编辑的等位基因，可一定程度的提升花序分生组织的大小，进而显著提升数个产量相关性状及单穗的籽粒产量。它们在自交系背景及杂交种背景下，均能显著提升产量。这些等位基因对产量的提升，主要体现在果穗增粗、穗行数增加、单穗粒数的增加；相对于对照，在穗行数上的提升十分显著，提升了~6行，且粒重未出现显著变化，最终单穗产量提升约最多至~26%。该研究还发现，其中一个启动子倒位的编辑等位基因，扩张了ZmCLE7的表达部位，因此导致果穗变小，降低了产量。这些结果表明，对ZmCLE7和ZmFCP1启动子的编辑，可以通过数量上调节基因表达，影响其对玉米花序分生组织活性的影响，影响玉米产量性状的数量变异，显著提升玉米的单穗产量。玉米中的CLAVATA3（ZmCLE7和ZmFCP1）的同源基因共有49个，研究者前期研究发现，CLAVATA3及同源基因，在多物种中往往都具有功能冗余的特性。例如在Zmcle7突变体中，ZmFCP1可通过表达量上调，弥补一定的ZmCLE7的功能。研究者进而通过对Zmcle7突变体转录组的分析，筛选到了另外一个CLAVATA3同源基因ZmCLE1E5，其在Zmcle7突变体中，也表现为表达量上调。研究者对其编码区进进行编辑，获得了两个不同移码突变的null alleles突变体。Zmcle1e5突变体的花序分生组织发育相对正常，但是显著增大，果穗显著增大，穗粒数增加，果穗形态正常，产量显著提升，且Zmcle1e5可显著增强Zmcle7突变表型，因此，ZmCLE1E5可部分互补ZmCLE7的功能。进而表明，同过对ZmCLE7互补因子的基因编辑，同样可以创制ZmCLE7启动子编辑类似的高产等位基因。玉米产量是极为复杂的数量性状，前人利用全基因组关联分析、连锁分析等手段，鉴定了数百个产量相关性状的QTL位点（www.maizegdb.org/qtl），其中大部分为微效QTL位点，且仅有少数位点被克隆，例如穗行数QTL位点KRN4，控制百粒重的QTL qHKW1、控制行粒数的KNR6等（Liu et al 2015; Yang et al 2019; Jia et al 2020）。这些QTL位点往往仅在一定的遗传背景下，才表现出较大的遗传效应，例如KRN4位点在H21背景下，可增加穗行数2.2行，而在Mo17背景下，其穗行数效应只有0.7行（Liu et al 2015）。另外，这些QTL位点的优良等位基因，往往在优良自交系群体中已被富集，进一步限制了这些位点在育种中的应用。而另外一方面，一些控制产量相关性状发育的关键基因，却不存在可导致表型数量变化的自然变异位点，一方面可能由于这些基因的优良自然变异位点本身就不存在，或者在驯化和改良中由于瓶颈效应丢失。例如，本研究涉及的两个CLAVATA3同源基因ZmCLE7和ZmFCP1，在具有广泛遗传变异的NAM群体里，并未检测到控制相关性状的QTL或关联位点（Brown et al 2011）。因此，该研究利用基因组编辑技术创制的ZmCLE7和ZmFCP1优良等位基因为新的基因资源。ZmCLE7和ZmFCP1调控区域编辑的优良等位基因，精细调控候选基因的表达水平，平衡其在花序发育中的功能，最终强化玉米产量性状表现，数量水平提高玉米籽粒产量，且它们的产量相关性状的效应，大于目前已克隆的任意QTL位点（Liu et al 2015; Yang et al 2019; Jia et al 2020）。除了启动子编辑策略，该研究还提出了对分生组织发育关键基因的互补基因进行编辑，也可优化分生组织活性，创制高产优良等位基因的策略。综上所述，该研究一方面创制了优良等位基因资源，另一方面，为重要基因的再利用提供了新的思路。参考文献： 1. Bommert P, Lunde C, Nardmann J, Vollbrecht E, Running M, Jackson D, Hake S, Werr W. thick tassel dwarf1 encodes a putative maize ortholog of the Arabidopsis CLAVATA1 leucine-rich repeat receptor-like kinase. Development, 2005, 132(6):1235–1245 2. Bommert P, Nagasawa NS, Jackson D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nat Genet, 2013b, 45(3):334–337 3. Brown PJ, Upadyayula N, Mahone GS, TianF, Bradbury PJ, Myles S, Holland JB, Flint-garcia S, Mcmullen MD, Buckler ES, Rocheford TR. Distinct Genetic Architectures for Male and Female Inflorescence Traits of Maize. PLoS Genet, 2011, 7(11):e1002383 4. Doebley JF, Gaut BS, Smith BD. The molecular genetics of crop domestication. Cell, 2006, Dec 29;127(7):1309-21 5. Duvick DN The contribution of breeding to yield advances in maize (Zea mays L.). Adv. Agron, 2005, 86, 83–145. 6. Je BI, Gruel J, Lee YK, Bommert P, Arevalo ED, Eveland AL, Wu Q, Goldshmidt A, Meeley R, Bartlett M, Komatsu M, Sakai H, Jönsson H, Jackson D. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nat Genet, 2016, Jul;48(7):785-91 7. Jia H, Li M, Li W, Liu L, Jian Y, Yang Z, Shen X, Ning Q, Du Y, Zhao R, Jackson D, Yang X, Zhang Z. A serine/threonine protein kinase encoding gene KERNEL NUMBER PER ROW6 regulates maize grain yield. Nat Commun, 2020, Feb 20;11(1):988 8. Liu L, Du Y, Shen X, Li M, Sun W, Huang J, Liu Z, Tao Y, Zheng Y, Yan J, Zhang Z. KRN4 Controls Quantitative Variation in Maize Kernel Row Number. PLoS Genet, 2015b, 11(11): e1005670 9. Rodríguez-Leal, D., Lemmon, Z. H., Man, J., Bartlett, M. E. & Lippman, Z. B. Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing. Cell, 2017, 171, 470-480.e8 10. Rodriguez-Leal D, Xu C, Kwon CT, Soyars C, Demesa-Arevalo E, Man J, Liu L, Lemmon ZH, Jones DS, Van Eck J, Jackson DP, Bartlett ME, Nimchuk ZL, Lippman ZB. Evolution of buffering in a genetic circuit controlling plant stem cell proliferation. Nat Genet, 2019, May;51(5):786-792. 11. Taguchi-Shiobara F, Yuan Z, Hake S, Jackson D. The fasciated ear2 gene encodes a leucine-rich repeat receptor-like protein that regulates shoot meristem proliferation in maize. Genes Dev, 2001, 15:2755–2766 12. Vollbrecht E, Schmidt RJ. Development of the inflorescences. In: Bennetzen JL, Hake S, eds., Handbook of Maize: Its Biology. New York: Springer, 2009. 13-40 13. Williams L, Fletcher JC. Stem cell regulation in the Arabidopsis shoot apical meristem. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8(6):582–586 14. Yang N, Liu J, Gao Q, Gui S, Chen L, Yang L, Huang J, Deng T, Luo J, He L, Wang Y, Xu P, Peng Y, Shi Z, Lan L, Ma Z, Yang X, Zhang Q, Bai M, Li S, Li W, Liu L, Jackson D, Yan J. Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement. Nat Genet, 2019, Jun;51(6):1052-1059. 论文链接： www.nature.com/articles/s41477-021-00858-5
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