固相萃取小知识，玩转SPE方法开发

近年来分析检测技术有了很大的飞跃，但样品前处理依然是科研工作者必须面对的挑战。下面就由小析姐和大家聊一聊固相萃取小柱方法开发中需要注意的问题。

固相萃取（Solid Phase Extraction，简称SPE）是一种从二十世纪七十年代中期开始发展起来，用途广泛而且越来越受欢迎的样品前处理技术。根据吸附剂填料及吸附机理的不同，主要分为正相、反相、离子交换和混合型固相萃取小柱。正相、反相固相萃取小柱主要是用来萃取分离极性和非极性化合物，但对一些带电物质（离子化合物）的萃取回收率并不高，如C18填料固相萃取小柱，当目标化合物呈离子状态时，C18对于该化合物的容量因子就会大大降低。

离子交换固相萃取适用于可解离成带电离子的化合物，其机理是利用带电荷的目标化合物离子与带相反电荷的吸附剂之间的静电吸引力。样品基质可以是极性的，如水溶液，也可以是非极性的有机溶液，但在实际应用中以水溶液较多，包括生物体液、江河湖海等自然水、废水等。

下面就由小析姐为大家介绍离子交换固相萃取小柱方法开发中需要注意的问题。

方法开发

我们要分析的目标化合物必须具备下列任意一种或以上的官能团才能通过离子作用力将其从样品溶液中分离出来：

（1）可生成阳离子的官能团（带正电荷）

（2）可生成阴离子的官能团（带负电荷）

而且待分析的目标化合物必须在一定的pH环境下才能呈离子化或中性化。

要有效地利用离子交换机理将目标化合物吸附在SPE柱上，必须满足以下两个条件：

（1）目标化合物离子与吸附剂官能团的离子态带相反电荷；

（2）萃取环境的pH必须同时使目标化合物和吸附剂上的官能团带电荷；

（3）萃取环境不能含有高浓度的带有和目标化合物相同电荷的竞争化合物。

在实际操作中，为了满足前两个条件，确保99%以上的目标化合物及固相萃取吸附剂上的官能团能够呈离子态或呈中性状态，应该根据目标化合物及固相萃取吸附剂官能团的pKa来调节样品或SPE柱的pH。

那么小编为大家介绍一下pH与pKa值的关系：

对于一个可生成离子的化合物，pKa是该化合物50%呈离子状态，50%呈中性状态时的pH。

就弱酸性化合物HA而言，其在水中的解离平衡方程式为：

根据Henderson-Hasselbach方程式，上述平衡方程式可以表示为：

为了方便使用，将上述公式改写为：

从式三可以看到，当pH与pKa相同时，[A⁻]/[HA]为1。也就是说，这时50%的弱酸性化合物呈阴离子状态，另外50%呈中性状态。在该pH环境下，即便这些呈阴离子状态的化合物100%地被阴离子交换剂吸附，之后又100%地被洗脱，最高回收率也只能达到50%。因为只有50%的弱酸性化合物呈离子状态，并被阴离子交换剂吸附。由此可见在离子交换固相萃取中，控制环境的pH十分重要。

[A⁻]/[HA]越大，代表弱酸性化合物离子化程度越大。理论上，当[A⁻]/[HA]等于100时，99%的弱酸性化合物呈阴离子状态，可以被阴离子交换剂吸附。根据式三，在进行阴离子固相萃取吸附时，要使弱酸性化合物99%离子化，样品基质的pH应该高于该化合物pKa至少两个pH单位。反之，在对该弱酸性化合物进行洗脱时，应该将环境的pH调节至低于该化合物pKa至少两个pH单位，此时弱酸性化合物99%呈中性状态，用适当的溶剂就可以将其从阴离子交换柱上洗脱下来。

式三同样可以用于可生成阳离子官能团的弱碱性化合物。这时我们将弱碱性化合物看作共轭酸[HA+]，并将该公式改写为：

与弱酸性化合物相反，在阳离子交换固相萃取中，要使弱碱性化合物99%解离为阳离子，需要将该弱碱性化合物所处的环境体系的pH应该低于该化合物pKa至少两个pH单位。而在洗脱时，环境体系的pH应该高于该化合物的pKa至少两个pH单位，此时99%的该化合物呈中性状态，用适当的溶剂就可以将其从阳离子交换柱上洗脱下来。

离子交换固相萃取柱种类的选择：为了能够有效地将被吸附的离子化合物洗脱出来，对于含有强离子官能团的目标化合物一般选用弱离子交换柱；而对于含有弱离子官能团的化合物，则可选用强离子交换柱。这样可以避免目标化合物和吸附剂官能团同时处于离子化状态，导致目标化合物始终处于的保留状态无法被洗脱。

作用机理

离子交换固相萃取小柱吸附机理及方法开发中需要注意的问题。想必大家已经知道离子交换SPE小柱主要针对在萃取环境中可解离成带电离子的化合物，那么填料为正相吸附剂和反相吸附剂主要用来分析哪些化合物呢？

首先，我们先简要了解一下反相萃取与正相萃取的吸附机理。

1、反相作用机理：

反相萃取分离主要是利用固相萃取材料官能团上的碳氢键与目标化合物的碳氢键之间的非极性作用力。通常，非极性的反相SPE柱较为适用于从极性基质中萃取分离非极性及中等极性的目标化合物。

对于通过非极性作用力吸附在非极性SPE柱上的目标化合物，可以用具有非极性性质的溶剂洗脱，如氯仿、环己烷、乙酸乙酯等。只要溶剂的洗脱强度足以破坏目标化合物与吸附剂非极性官能团之间的范德华力，就可以顺利地将目标化合物从SPE柱上洗脱下来。即便是极性较强的甲醇，对于许多化合物来说也具有足够的非极性作用力将其洗脱。有时单一溶剂不能把疏水性强的目标化合物完全洗脱下来，则可考虑使用二氯甲烷：乙酸乙酯（1：1，体积比）。

反相固相萃取模式下，溶剂体系的极性应按照样品溶剂、淋洗溶剂、洗脱溶剂的顺序逐渐降低，而它们的洗脱强度逐渐增大。必须保证选择的样品溶剂不能将目标化合物洗脱，选择的淋洗液应在不洗脱目标化合物的前提下最大限度地洗脱干扰物，所选洗脱液应能恰好完全洗脱目标化合物。

2、正向作用机理：

极性作用力发生在许多固相萃取材料极性表面与样品中目标化合物的极性官能团之间。常见的具有极性作用力的吸附剂在色谱中一般都称为正相色谱吸附剂。极性作用力的强度比非极性作用力要大，但比离子作用力的强度小。常见的极性官能团包括羟基、胺基、巯基等。

非极性的基质环境有利于吸附剂和目标化合物之间的极性作用力，因为非极性溶剂没有能够与极性固定相材料形成氢键的官能团。因此，在极性作用力的固相萃取中，样品的基质多为非极性的，如正己烷、二氯甲烷、菜油等，而目标化合物多含有极性较大的官能团。

常见的极性固定相萃取材料包括：硅胶、氧化铝、弗罗里硅土及含有氰基（CN）、氨基（NH2）、二醇基（2OH）的键合硅胶。

正相固相萃取模式下，溶剂体系的极性应按照样品溶剂、淋洗溶剂、洗脱溶剂的顺序逐渐升高，它们的洗脱强度也逐渐增大。必须保证选择的样品溶剂不能将目标化合物洗脱，选择的淋洗液应在不洗脱目标化合物的前提下最大限度地洗脱干扰物，所以洗脱液应能恰好完全洗脱目标化合物。

加上之前为大家介绍的离子交换固相萃取技术，现在又面对反相、正相固相萃取，如此之多的吸附机制，实际应用中我们该选哪一个呢？下面小编就为大家做一个具体的分析。

由于许多化合物同时具有多种官能团，在选择固相萃取机理时，应该根据目标化合物及干扰物的性质来考虑采用哪种萃取机理较为有利。如：2-萘胺是一个弱碱性化合物（pKa=4.16），在一定的pH条件下还可以呈阳离子状态，同时该化合物具有疏水的非极性官能团及亲水的极性官能团。这时，就应该根据样品基质的具体情况来选择有利于将目标化合物与干扰物分离的萃取机理。如果样品基质中同时含有大量的非极性干扰杂质，就应该避免采用非极性的萃取机理，而将样品的pH调节到低于其pKa两个pH单位，即pH=2.16，并采用阳离子交换机理。反之，如果样品中同时含有大量的阳离子干扰杂质，则应该调节样品的pH至6.16（高于pKa两个单位），采用非极性萃取机理较为有利。

保留机制第一影响因素：目标分析物官能团的性质

保留机制第二影响因素：样品基质的性质

为了提高分析测定效率，使用好固相萃取小柱是非常有必要，但固相萃取技术的复杂、难搞也是人所共知，下面列举了一些固相萃取操作中的常见的问题及解决办法，希望能对你的固相萃取操作有所帮助。

以下是固相萃取操作中常见的问题：

一、回收率低；

二、萃取重现性差；

三、净化效果不理想；

四、SPE柱流速过低。

一、回收率低

在一次完整的SPE操作中，目标化合物可能会存在于样品溶液流出液、淋洗液、洗脱液或吸附剂中，当“目标物没有回收或回收率低” 现象发生时，可向样品溶液加入标液，然后进行完整的SPE操作并将样品流出液、淋洗液和洗脱液分别收集并分析。

首先确定目标化合物存在于哪一部分，进而确定问题来自下列哪一环节：目标化合物在吸附剂上保留不足；目标化合物未被完全洗脱；其他环节。

1、目标化合物在吸附剂上保留不足

当超过5%的目标化合物出现在样品流出液或淋洗液时即可断定“目标化合物在吸附剂上的保留不足”。

2、目标化合物未被完全洗脱

当目标化合物在样品溶液流出液和淋洗液中未出现而洗脱液中仅有少量或未出现时，可判断“目标物未被完全洗脱”。

3、其他环节

如果目标化合物在洗脱液中正常出现，那么回收率不足的问题应该来自样品前处理的其他环节。

二、萃取重现性差

在使用固相萃取小柱进行样品前处理时，若出现萃取效果重现性差，可能的原因及改进办法如下：

三、净化效果不理想

1、净化模式的改进

通常而言采用保留目标化合物的模式比保留杂质的模式净化效果好，如果正在分析的项目为某一种或某一类化合物分析，最好是采用保留目标化合物的净化模式；举一个简单的例子，同样是分析蔬菜中的多菌灵和噻菌灵(一类碱性农药)，使用阳离子交换柱可以专一性地保留这些农药，使它们基本与干扰物完全分离，而使用正相吸附剂或石墨化炭黑进行保留干扰物的操作仅能把主要的干扰物除去，仍有较多干扰物存留。

另外，如果不止一种SPE柱可用于目标化合物的净化时，应挑选选择性好的吸附剂；选择性方面，离子交换＞正相＞反相。

2、淋洗液和洗脱液的优化

对于反相模式和正相模式，应在不影响回收率的前提下，增大淋洗液洗脱的强度并降低洗脱液的洗脱强度。 

对于反相模式，可将目标化合物的水溶液上样，然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇水溶液洗脱，分别收集洗脱液分析，建立淋洗曲线，找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系，淋洗液中甲醇的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系，而洗脱液中甲醇的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系；当纯甲醇不能洗脱目标化合物时，应试验甲醇-甲基叔丁基醚混合溶液的洗脱曲线；对于某些既不溶于水也不溶于甲醇的离子型化合物，可以在溶剂体系中加入酸或碱。

对于正相体系，可将目标化合物的正己烷溶液上样，然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的正己烷甲基叔丁基醚溶液洗脱，分别收集洗脱液分析，建立淋洗曲线，找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系，淋洗液中甲基叔丁基醚的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系，而洗脱液中甲基叔丁基醚的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系。

3、对SPE柱进行合理的处理

SPE柱中的吸附剂可能存在少量干扰物，有效地活化可以避免这些干扰物进入洗脱液，活化溶液应选择整个操作中洗脱强度最强的溶剂体系；在反相模式中，从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100%甲醇水溶液，所以活化溶液应选纯甲醇，当目标化合物需要用甲醇-甲基叔丁基醚混合液洗脱时，活化溶液应选甲基叔丁基醚；在正相模式中，从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100%正己烷-甲基叔丁基醚溶液，所以活化溶液应选纯甲基叔丁基醚。

四、SPE柱流速过低

使用固相萃取小柱过程中，若出现SPE柱流速过低的情况，可能的原因及改进办法如下：

关于固相萃取小知识，相信小伙伴们已经了如指掌，接下来就在SPE方法开发中大显身手吧。

为了帮助大家的解决样品前处理过程中常见的一些问题，小析姐筹备了一场样品前处理的在线公开课，此次课程就样品前处理技术的发展现状、最新进展、常用前处理技术的操作及相关技术要点、经验。希望通过本次技术交流，可以在提高实验人员的分析检测水平外，还能促进实验室前处理水平的进一步发展及提升。

（内容来源：网络 由小析姐整理编辑）