PCR实验室的功能用房有试剂配制室、样品处理室、核酸扩增室和产物分析室（也可扩增与分析同为一室）。各室在物理空间上必须完全独立、在使用中应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。因此每一个房间都会设置缓冲间，用于维持主主操作间的压差和隔绝各室的空气。
试剂准备室（一区）：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。
样品处理室（二区）：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。
核酸扩增室（三区）：cDNA合成、DNA扩增及检测。
产物分析室（四区） ：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。
一般情况下，房间的压差有正压和负压两种，房间维持正压，主要是为了防止外部的污染源侵入，气流的方向是由内向外；房间维持负压，主要是为了防止内部污染源的扩散，气流的方向是由外向内。
关于PCR实验室的功能用房环境设计参数，在《疾病预防控制中心建筑技术规范》GB50881-2013中这样要求：
功能用房 | 室内 气压 | 冬季室内 | 夏季室内 | 洁净度等级 | 备注 |
温度（℃） | 湿度 （%） | 温度 （℃） | 湿度 （%） |
试剂配制室 | 微正压 | 18-20 | 40-60 | 25-27 | 45-65 | — | 单向流 |
样品处理室 | — | 18-20 | 40-60 | 25-27 | 45-65 | — | 单向流 |
核酸扩增室 | 微负压 | 18-20 | 40-60 | 25-27 | 45-65 | — | 单向流 |
产物分析室 | 微负压 | 18-20 | 40-60 | 25-27 | 45-65 | — | 单向流 |
“—”表示不做要求
从原理上讲，所有防止污染源的房间均应设置为正压，以避免外部污染源的入侵。比如常规的无菌检测室、超净工作台等遵循的就是正压原则；所有产生污染源的房间均应设置为负压，以防止内部污染源的扩散，如特殊的生物安全实验室、PCR扩增室等都应设置为负压。通风柜和生物安全柜遵循的就是负压原则。
对于集中布置的PCR实验室：
试剂准备主操作间和缓冲间设置为正压，
样品处理主操作间和缓冲间设置为微负压，
核酸扩增和产物分析主操作间和缓冲间设置为负压，以防止扩增与电泳操作过程中产生的气溶胶会在开门过程中扩散到走廊，进而扩散到试剂准备室和样品处理室而导致结果的假阳性。
样品处理虽是污染操作，但是在生物安全柜内进行的，生物安全柜的功能主要通过去除感染性气溶胶，保护实验样品、操作者本人和实验室环境，使其避免暴露于操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物。
PCR实验室的试剂配制室、样品处理室、核酸扩增室及产物分析室之间不应共用空调回风系统。核酸扩增室及产物分析室邻室还应维持相对微负压差。
