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1.1、抗体的基本要求 a. 清楚知道待测靶标，胞内还是胞外蛋白； b. 严格按照样品来源选择种属； c. 必须选择流式抗体。 1.2、流式细胞仪的要求 a. 知道机器有几个激光器，目前488、635nm激光器较多； b. 知道每个激光器下有几个通道，通道数决定一次最多测多少指标； c. 如：BD的C6这款机器，有488和640两个激光器，4个通道。 1.3、荧光标记的选择 a. 有直标抗体的话，尽量选直标，间标染色准确性低； b. 弱表达靶标，尽量选择强荧光素标记抗体，PE>APC>PerCP>FITC。 目前荧光素有很多种，Cy系列标记在耐光性和亮度上有增强，Alexa fluor系列为新型荧光标记，特点是激光稳定性好，亮度高，pH耐受强，水溶性强。还有一些小分子标记，如PI，CFSE等。复合标记抗体，如PerCP-Cy5.5等。 1.4、多色搭配方案 a. 每个通道只能用一种标记，如FITC和Alexa fluor 488，两种标记的激发波长和发射波长均相近，所以不能同时用这两种标记； b. 尽量减少光谱重叠，如PE-cy5和APC，两者同用时调补偿值过大； c. 弱靶标配强荧光素，如巨噬细胞CD16表达量高于CD14，所以CD14应使用强荧光素标记抗体； d. 五色及以上配色建议查阅文献，或者咨询抗体厂商。 |
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