橘皮所含的川陈皮素具有延缓衰老药作用

川陈皮素来源于芸香科川橘 Citrus nobilis Lour.果皮,酸橙 C.aurantium L.果皮,柑橘 C.reticulata Blanco 叶,茎.别名：川皮亭、蜜橘黄素

2019年Nature Communications刊登了一项题为“Nobiletin fortifies mitochondrial respiration in skeletal muscle to promote healthy aging against metabolic challenge”的研究。该研究来自美国德克萨斯大学的Zheng Chen教授的研究团队，他们致力于发现调控昼夜节律的小分子化合物以及探究其作用机制。

川陈皮素（Nobiletin，NOB）是一种视黄酸相关孤核受体（retinoid acid receptor-related orphan receptor，ROR）的激活剂，该团队前期鉴定出川陈皮素，它可以改善机体昼夜节律振荡与维持代谢稳态（CellMetab，2016）。但是维持昼夜节律稳定是否有利于延缓机体衰老尚不清楚。该研究探究了NOB对小鼠骨骼肌生物能量学与代谢变化的调控作用，发现NOB-ROR轴能够改善线粒体呼吸复合物的活性与功能，从而延缓骨骼肌衰老。这一发现为我们提供了一种通过调控生物钟与代谢水平从而延缓衰老的药物治疗策略。

图3 川陈皮素结构简式

首先，研究人员探究了NOB对于机体衰老与昼夜节律的影响。NOB干预正常饮食的老年小鼠20周后，研究者发现NOB可以延长小鼠的平均寿命，并且能够延长其平均睡眠时间（图4）。除此之外，NOB还表现出维持机体葡萄糖稳态，提高能量消耗量，以及改善昼夜节律的生物效应。以往报道显示NOB可以显著改善营养过剩的年轻小鼠的机体代谢状况（Nutr.Metab，2015），于是研究人员探究了NOB对高脂饮食小鼠的能量稳态（energy homeostasis）的影响。意想不到的是，NOB能够在不改变卡路里摄入量（calorie intake）的情况下，减轻小鼠体重以及降低总脂肪重量（图5）。（岂不是有了NOB，可以肆无忌惮地吃吃吃，然后还能瘦瘦瘦！）

图4 NOB可以延长小鼠生存期及平均睡眠时间

图5 NOB可以不改变小鼠摄食量而降低其体重与总脂肪重量

那么，NOB改善代谢状况的出色表现究竟是由什么机制介导的呢？有研究表明NOB可以有效地改善小鼠肌肉的衰老表征，而内源性生物钟是机体代谢与衰老的基本调节机制，因此研究人员将这两者联系起来，推测NOB可能是通过增强骨骼肌的昼夜节律及功能，从而维持老年小鼠的健康代谢状况。研究者们先是通过甘油三酯水平与油红O染色检测骨骼肌的脂质水平以探究老年小鼠骨骼肌的脂质代谢变化，结果表明NOB可以逆转高脂饮食引起的脂质过度累积。而脂质的大量堆积则会引发脂毒性、能量稳态活动沉默以及胰岛素抵抗等。随后研究人员在NOB干预的小鼠骨骼肌中检测了昼夜节律基因的表达变化，发现ROR下游基因Bmal1，Npas2，Dec1均发生明显上调（图6）。同时研究者也观察到RORα与RORγ蛋白水平得到提高。这些结果印证了NOB-ROR主要是通过调控骨骼肌中Bmal1，Npas2，Dec1三种昼夜节律基因的表达而改善机体衰老状态。

图6 Bmal1、Npas2与Dec1基因的表达上调

注：ZT6（Zeitgeber Time 6），ZT18(Zeitgeber Time 18)表示样品取材的两个时间点

接下来，研究人员对骨骼肌进行了转录组测序。通路分析显示NOB能够显著调控线粒体功能，即NOB可以持续诱导编码线粒体呼吸复合物(mitochondrial respiratory chain complex，MRC)I-V基因的表达，其中对39%的MRC基因的诱导度可达到甚至高于50％。研究人员同时将RNA-seq结果与染色质免疫沉淀测序研究进行关联分析（Science，2012；PLoS Genet，2014），鉴定发现NOB能够通过结合的Clock / Bmal1启动子的E-box元件，以及Ror与Rev-Erb启动子的RORE元件，从而调控昼夜节律基因的表达。

随后研究者们把目光聚焦于线粒体。作者通过胞外通量分析测定了线粒体的生物能量学变化，发现NOB可以增强小鼠骨骼肌内线粒体的呼吸能力，如ATP相关耗氧速率回升，这暗示着线粒体内ATP合成能力得到了改善（图7）。以往研究表明线粒体呼吸除了产生ATP，也会生成活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）。而ROS就不像ATP那样友好了，它的过度积累会在衰老过程中损害我们的细胞。因此，研究人员测定了线粒体内抗氧化酶的mRNA表达水平，包括谷胱甘肽过氧化物酶1和硫氧还蛋白2，二者分别由RORγ的靶标基因Gpx1（Glutathione peroxidase 1）、Txn2（Thioredoxin 2）编码。研究者发现经NOB干预后，取材时间点ZT6处的谷胱甘肽过氧化物酶1和硫氧还蛋白2的mRNA均恢复至生理水平（图8）。令人振奋的是，NOB既可以抑制氧化应激，又能维持ATP生成量（简直太优秀了）。

图7 经20周NOB干预的小鼠肌组织线粒体内ATP相关耗氧速率

图8 qPCR结果显示NOB增强含有RORE的抗氧化基因的表达

最后，研究人员探究了NOB对于骨骼肌代谢稳态的影响。偏最小二乘法判别分析（Partialleast-squares Discriminant Analysis，PLS-DA）与变量投影重要性分析（Variable Importance in Projection，VIP）发现富马酸与苹果酸在三羧酸循环中发生明显上调，而他们的前体琥珀酸却发生下调（图9）。于是研究者认为线粒体呼吸复合体Ⅱ（三羧酸循环与电子传递链的交联点）也是NOB的一个关键调控靶点，而后通过酶联免疫法证明了NOB可以显著增强线粒体呼吸复合体Ⅱ的活性。但是，NOB只能轻微地改变细胞内葡萄糖的水平（图10A），研究者认为还存在着其他糖酵解中间物靶标。电子传递链中的递氢体NADH是线粒体呼吸底物，以及NADH的氧化态NAD 是糖酵解的底物，也是衰老过程中重要的能量表征。进一步实验表明了NOB可以上调NAD /NADH的比率（图10 B），同线粒体呼吸能力得以改善的结果是相一致的。

图9 糖酵解与三羧酸循环通路分析

图10 NOB提高骨骼肌细胞内葡萄糖水平与NAD /NADH比率

综上所述，研究者阐明了昼夜节律靶向性药物NOB延缓衰老的机制，即NOB-ROR轴通过上调骨骼肌内昼夜节律相关基因，以及调控线粒体呼吸复合物的基因表达而优化线粒体呼吸作用。该研究发现了一种可延缓机体衰老的新颖小分子药物，以及揭示了生物节律参与衰老调控的新型分子机制，为延缓人类衰老提供了新的视角。

参考文献：

[1] He, B. et al. The small moleculenobiletin targets the molecular oscillator to enhance circadian rhythms andprotect against metabolic syndrome. Cell Metab. 23, 610–621 (2016).

[2]. Nohara, K. et al. Ammonia-loweringactivities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of anatural flavonoid. Nutr. Metab. (Lond.) 12, 23 (2015).

[3] Koike, N. et al. Transcriptionalarchitecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals.Science 338, 349–354 (2012).

[4] Takeda, Y. et al. Retinoicacid-related orphan receptor gamma (RORgamma):a novel participant in thediurnal regulation of hepatic gluconeogenesis and insulin sensitivity. PLoSGenet. 10, e1004331 (2014).