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作者：浙江中医药大学第三临床医学院 胡蓉
脊髓损伤（SCI）会导致损伤水平以下自主神经元损伤，运动和感觉的障碍，肠、膀胱等功能的丧失，交通事故和外伤是导致该病发生的主要原因，随着老龄化社会的发展，椎管狭窄、自发性压迫性脊髓损伤患病率不断增加，也会导致脊髓损伤发病率进一步上升。一般来说，脊髓损伤后可出现神经元死亡，脱髓鞘，轴突变性，炎症，神经胶质瘢痕形成和囊性空化等病理现象，并能引起神经网络破坏、重组等一系列可塑性变化，从而导致神经信号传导中断和神经功能丧失。Holmes最新研究认为：随着对中枢神经系统（CNS）损伤部位微环境作用的理解逐步加深，有可能找到改善中枢神经系统神经再生的方法：一方面，可以通过干扰受损神经元的内部调节途径，重新启动神经元固有的再生途径；另一方面，改善脊髓损伤神经局部微环境，从而消除抑制神经轴突再生的分子因素，减少炎性浸润，促进损伤后神经功能的恢复。以往研究主要侧重于神经元固有抑制因子对脊髓损伤后功能恢复的影响，而忽略了神经元外环境在脊髓损伤后功能恢复中的作用。目前越来越多的学者研究发现，神经元外环境对脊髓损伤的功能恢复同样重要。神经元胞外基质网络（PNNs）是由中枢神经系统细胞外基质组成的重要神经元外环境之一，由细胞外基质和不同的糖胺聚糖，蛋白聚糖（PG）在某些神经元周围凝结形成，在稳定细胞微环境、维持神经元性能、保护神经元免受有害物质影响等方面起到了重要的作用，同时也参与调节多种中枢神经系统疾病发病机制。在脊髓损伤模型中，PNNs高度结构化，包裹在细胞外构成了神经元和细胞外之间的物理屏障，阻碍神经恢复，而使用酶法去除PNNs可促进脊髓损伤后功能恢复。在脊髓损伤继发性病变的产生和治疗效应的过程中，如何促进脊髓神经轴突的再生以及如何减弱损害神经再生的炎性反应，一直是脊髓神经损伤修复研究领域亟待解决的问题。本文论述了PNNs的组成以及它们在脊髓损伤后神经再生与神经炎症中的影响及潜在治疗应用。神经元胞外基质网络的组成 PNNs被发现以来，近几十年来，不断有学者对其可视化、显微解剖结构、组成以及与神经功能相关性等方面进行了广泛的研究，发现大脑和脊髓中的PNNs由相同的分子组成，脊髓腹角中约30％的运动神经元，中央灰质中50％的大中性神经元和背角中20％神经元的周围存在PNNs。目前已知的PNNs主要组成包括硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG），透明质酸（HA），连接蛋白（Crtl1）和肌糖蛋白（TN）。其中，CSPG包括Lecticans家族，即聚集蛋白聚糖（aggre-can），多功能蛋白聚糖（versican），神经蛋白聚糖（neurocan），短小蛋白聚糖（brevican），磷酸酶蛋白聚糖（phosphacan），硫酸软骨素蛋白聚糖2（NG2）等多种类型。聚集蛋白聚糖存在于所有的PNNs中，而神经蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖2和磷酸酶蛋白聚糖仅存在于部分PNNs中。神经元胞外基质网络主要组成的特征 透明质酸透明质酸是由数百个重复的二糖亚基组成的聚合物，并且是PNNs中惟一不被硫酸化或未结合到蛋白核心的糖胺聚糖。透明质酸由透明质酸合酶（HAS）直接在细胞外空间形成，它存在3种透明质酸合酶异构体（透明质酸合酶1、透明质酸合酶2、透明质酸合酶3，即分别为HAS1、HAS2、HAS3），它们合成各种长度和速度不同的透明质酸链，而HAS1和HAS2快速产生可达2000kDa的透明质酸长链，而HAS3则以慢速产生透明质酸短链。3种透明质酸合酶均在核周围表达，而脊髓的神经元则表达HAS1和HAS3，但HAS3是成熟脊髓中惟一鉴定出的亚型。分解HA后导致PNNs缺失，表明HA在维持PNNs结构完整性中发挥重要作用。硫酸软骨素蛋白聚糖硫酸软骨素蛋白聚糖由两个核心蛋白域组成：C末端的全局域G3和N末端的一个或两个全局域（G1和G2），G1结构域包含一个免疫球蛋白和两个重复的蛋白聚糖；G2域仅在聚集蛋白中发现，包含两个重复的PG，G1结构域中的重复蛋白聚糖可以通过连接蛋白与HA结合。有研究发现，脊髓损伤部位CSPG表达增加，通过软骨素酶分解CSPG后，能有效促进轴突再生和神经元修复。肌糖蛋白肌腱蛋白家族由4种不同的糖蛋白组成，但迄今为止，在神经元和神经胶质细胞中仅观察到肌糖蛋白－R（Tn－R）和肌糖蛋白－C（Tn－C）两种糖蛋白。在翻译后加工过程中的变化和基质金属蛋白酶（MMP）的活性的影响下，肌糖蛋白高度异质。肌糖蛋白C具有由两个均三聚体组成的四元结构，从而形成六聚体，Tn－R同时形成同二聚体和同三聚体。三聚体肌糖蛋白R和肌糖蛋白C与硫酸软骨素蛋白核心蛋白的c端结构域结合，形成有组织的PNNs主链。连接蛋白连接蛋白在透明质酸和硫酸软骨素蛋白聚糖的G1凝集素结构域之间形成非共价连接，阻止了凝集素扩散到细胞外基质中。连接蛋白家族由Crtl1、Crtl2、Crtl4、Bral2，4种不同的蛋白质组成，其中，Crtl1和Crtl4在被PNNs包围的神经元中表达，而Crtl2不仅在少突胶质细胞中表达，同时也存在于PNNs中。Kwok等研究表明，在人胚肾细胞（HEK）模型中，Crtl1在HAS3表达细胞中的过表达会形成弥散的细胞外基质，从而形成致密的细胞外基质网络，提示Crtl1对PNNs形成具有重要作用；在对Crtl1基因敲除小鼠细胞培养的研究中也再次验证了Crtl1在PNNs形成中的重要性。 一项系统定量的研究表明PNNs结构并非静态的，在发育中及脊髓损伤后PNNs数量和组成会发生变化，即为了保护和维持神经生长，也限制了损伤后神经修复，且目前仍没有完全有效的方法干预脊髓损伤后脊髓神经网络的重组和可塑性变化。神经元胞外基质网络对脊髓损伤后轴突再生的影响 在中枢神经系统中，轴突再生主要以轴突萌芽和突触形成为特征，脊髓损伤后神经功能障碍主要是由于损伤后引起的轴突中断，因此保留残余轴突并促进轴突修复和再生是脊髓损伤神经修复的重要步骤。然而，成年哺乳动物的中枢神经系统轴突在损伤后难以自行再生，其中阻碍脊髓损伤后轴突再生的外源性机制包括促生长分子的相对缺乏或在损伤环境中生长抑制分子的大量表达。脊髓损伤后3～14d损伤部位突触周围细胞外基质表达逐渐上调，神经周围神经网络高度聚集并迁移到病变部位，形成胶质瘢痕阻碍轴突的再生。凋亡和坏死的细胞释放出大量的警报蛋白启动一系列炎症信号传导，对改变后的微环境迅速做出反应，在炎性环境中，CSPG、TN－R等分泌增加，形成抑制性化学屏障，同时，炎症反应过程中释放的细胞因子会损害少突胶质细胞和神经纤维，导致轴突的脱髓鞘，限制轴突的再生。硫酸软骨素蛋白聚糖对脊髓损伤后轴突再生的影响 硫酸软骨素蛋白聚糖上调已在损伤后神经胶质瘢痕的病理学主要成分中进行了广泛研究。研究表明：脊髓损伤后PNNs中的CSPG表达上调并逐渐向损伤部位迁移，损伤后第2周达到高峰后保持长期上调，与星形胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞形成神经胶质瘢痕。CSPG可通过神经再生抑制剂受体蛋白酪氨酸磷酸酶受体σ（PTPσ）和白细胞共同抗原相关的蛋白酪氨酸磷酸酶（LAR），调控Rho／ROCK通路，抑制Akt和Erk1／2磷酸化介导的激活GTPase受体信号通路，导致生长椎塌陷，从而抑制轴突的生长。CSPG／PTPσ相互作用还可以通过抑制自噬体－溶酶体融合来调节轴突生长锥处的自噬通量，从而影响脊髓损伤后轴突的再生。并且在脊髓损伤后，抑制PTPσ或LAR信号后的确有助于增强脊髓损伤后轴突的再生。大量研究已经证明抑制CSPG后可促进脊髓损伤后轴突的再生，2002年Bradbury等首次发现在大鼠SCI模型中通过硫酸软骨素酶ABC（ChABC）降解CSPG可改善轴突生长。之后，这一结果也得到了其他学者验证。有研究发现，在联合治疗策略中，在受损脊髓部位持续注入ChABC酶1周后接受神经干细胞移植，移植的神经干细胞成功整合迁移到脊髓并分化为少突胶质细胞，骨髓基质干细胞（BMSCs）联合ChABC酶可促进神经纤维再生。可见，分解CSPG可以优化脊髓损伤后神经干细胞移植治疗策略，促进轴突的完整性和可塑性。肌糖蛋白对脊髓损伤后轴突再生的影响 发育中的中枢神经系统中肌糖蛋白TN－C可促进神经前体的增殖和迁移、轴突的延伸和生长锥的形成，成熟轴突中TN－C结合特定的异二聚体整联蛋白受体α9β1整合素，也可促进神经突增生和轴突再生。成年小鼠TN－C基因敲除后，在脊髓损伤中较正常小鼠出现更严重的皮质脊髓束轴突消退和死亡。而TN－C同家族的TN－R不同，脊髓损伤后损伤部位TN－R表达上调阻碍轴突的修复和再生。研究显示，采用局部给药TN－R多克隆抗体，透过破坏的血脊髓屏障持续渗透入损伤脊髓组织，阻断TN－R所导致的RhoA信号的激活，可以促进轴突生长。Apostolova等曾通过对TN－R基因敲除鼠的研究发现，脊髓损伤后TN－R可以阻碍运动神经元与其他神经元重建突触联系，从而限制了脊髓损伤后运动功能的恢复。一项关于脊髓损伤大鼠接受TN－C、TN－R诱导的人骨髓源性多能祖细胞注射治疗的研究显示：TN－C诱导组可显著增强微管相关蛋白2（MAP2），βIII微管蛋白和神经生长因子（NGF）的mRNA表达，而TN－R诱导组没有明显促进作用。确切完整的机制仍不清楚，尚待进一步阐明。由上可见，TN－C是脊髓损伤后神经再生所必需的，而TN－R和CSPG与脊髓损伤后神经修复及功能恢复呈负相关。神经元胞外基质网络对脊髓损伤后髓鞘形成的影响 脊髓损伤后中枢神经系统的髓鞘细胞少突胶质细胞被破坏、死亡，发生脱髓鞘现象。髓鞘再生主要通过少突胶质细胞前体细胞增殖、迁移至病变部位，在损伤后分化为髓鞘少突胶质细胞来实现，但是内源性少突胶质前体细胞分化能力有限，此外，有许多与髓磷脂相关的抑制因子被认为是促进中枢神经系统再生的关键机制，PNNs中的CSPG、HA还抑制少突胶质细胞前体细胞的存活、整合和迁移分化，进一步阻碍脊髓损伤后再髓鞘化。研究显示，CSPG可激活PTPσ受体和下游的Rho／ROCK途径，诱导神经前体细胞和少突胶质前体祖细胞群体的凋亡，并限制少突胶质前体细胞向少突胶质细胞分化、成熟和再髓鞘化。阻断PTPσ信号后可有效逆转CSPG对少突胶质前体细胞caspase3依赖性细胞死亡的抑制作用，促进内源性前体细胞分化成少突胶质细胞，减弱caspase3介导的成熟少突胶质细胞死亡并保留髓磷脂。另外，RNAi介导的PTPσ下调能够逆转CSPG对少突胶质细胞分化和髓鞘形成的抑制作用，并且体外实验中，将少突胶质细胞中PTPσ受体敲除后的培养物中，CSPG对髓鞘形成的抑制作用也显著降低，增加了少突胶质细胞分化和髓鞘形成。最近，研究者尝试其将人胚胎干细胞衍生神经干细胞包裹在透明质酸基水凝胶中，发现可以增加细胞向少突胶质细胞的分化，并改善其运动功能，发现利用透明质酸是提高脊髓损伤大鼠中枢神经系统活力和分化的良好选择。因此，PNNs中的HA、CSPG也是构成髓鞘形成的重要抑制因子。神经元胞外基质网络对脊髓损伤后神经炎症的影响 神经炎症不仅会加重损伤部位的疼痛感，还会造成炎症病灶处实质细胞的变性、坏死和代谢功能异常，减少受伤中枢神经系统的炎症可以改善神经元的再生。所以，减少脊髓损伤后继发性炎症反应，改善受损脊髓局部神经外环境，对脊髓损伤继发性病变的治疗和修复至关重要。在中枢神经系统中，神经炎症主要由常驻巨噬细胞（在中枢神经系统中，为小胶质细胞）介导，巨噬细胞有两种表型：经典激活的促炎（M1）表型和可选择激活的抗炎（M2）表型，脊髓损伤后7d内观察到少量M2小胶质细胞的瞬时激活和大量M1小胶质细胞的长期激活，并且通过抑制M1表型、促进M2表型的表达，或者将M2表型巨噬细胞移植至受损脊髓可促进SCI大鼠的运动恢复。因此，促进M2小胶质细胞极化可能是一种有希望的治疗策略，以促进SCI后的功能恢复，而PNNs与炎症之间的关系可能极大地影响内源性脊髓修复。透明质酸对脊髓损伤后神经炎症的影响 在健康脊髓中，高分子量透明质酸（分子量＞1000kDa）是主要的透明质酸表现形式，它通过星形胶质细胞释放到细胞外，并且可能通过阻断细胞外配体结合先天免疫受体的能力来降低小胶质细胞的炎症信号传导。研究发现，在组织受伤后透明质酸分裂形成低分子量透明质酸（分子量＜200kDa），通过信号转导途径刺激TLR－2和TLR－4刺激炎症性细胞因子的产生，而在脊髓损伤小鼠中发现TLR－2和TLR－4均增加，并在巨噬细胞／小胶质细胞和星形胶质细胞中表达。可见在脊髓损伤模型中低分子量透明质酸可能具有放大某些炎症反应的作用。另外，有学者基于上述研究进一步发现，在脊髓损伤治疗策略中，将高分子量透明质酸用于凝胶基质置入损伤部位，能有效抑制炎症反应和星型胶质细胞活化增生，通过调节炎症细胞因子水平，保护神经组织，改善轴突再生促进脊髓损伤大鼠的功能恢复。硫酸软骨素蛋白聚糖对脊髓损伤后神经炎症的影响CSPG最初被认定为是神经胶质瘢痕内轴突生长和可塑性的抑制剂，但新发现它也是内源性炎症反应的重要调节剂，CSPG在损伤后上调可能与促炎性刺激有关。脊髓损伤后CSPG硫酸化，糖胺多糖（GAG）被释放，通过结合免疫性受体、免疫细胞的信号分子激活免疫细胞，增强炎症反应，限制内源性修复。研究显示，CSPG结合LAR、PTPσ下游的Rho／ROCK促进小胶质细胞／巨噬细胞促炎性表型M1表型的激活，并且通过阻断LAR和PTPσ受体，减少与CSPG的结合，可降低促炎性细胞因子白介素1β的水平，并上调神经保护性小胶质细胞／巨噬细胞M2表型和T调节细胞的表达，增强SCI后的抗炎环境。很好地证明了在脊髓损伤中靶向CSPG受体会改善炎症反应。可见，减少炎症反应是促进SCI后有效恢复的新策略。肌糖蛋白对脊髓损伤后神经炎症的影响 肌糖蛋白在炎症中的作用尚未得到广泛的研究。随着不断深入研究，神经生物学家们发现，TN－R不仅影响神经元神经突起的生长，对少突胶质细胞、小胶质细胞等神经胶质细胞也产生不同的影响。因此，可进行进一步的研究来确定TN－R在脊髓损伤后炎症反应及轴突再生中的作用及机制。综上，脊髓损伤后PNNs组成成分的改变，与脊髓损伤后轴突再生、髓鞘形成及炎症反应密切相关。PNNs可阻碍髓鞘形成、轴突再生，并加重炎症反应，而炎症反应又进一步加重脊髓损伤后继发性病变，损害少突胶质细胞和神经纤维，导致轴突的脱髓鞘，限制轴突的再生，严重影响脊髓损伤后功能恢复。所以维持PNNs平衡和稳定性可减少脊髓损伤后继发性炎症反应，改善受损脊髓局部神经外环境，降低抑制神经轴突再生的有害因素。尽管通过有效分解内源性PNNs成分，抑制PNNs相关成分合成及其信号传导可减少脊髓损伤后的炎症蔓延，增加轴突可塑性，并能改善功能恢复。但是，目前在讨论神经元胞外基质网络在脊髓损伤修复中的作用时仍有许多问题存在，例如：各种脑区域内PNNs被很好地研究，但在脊髓中研究仍不深入。另外，不可忽略的是：如何诠释PNNs在脊髓损伤发病机制中的整体意义及动态平衡，仍有必要针对PNNs的系统调控进行研究挖掘。希望深入了解PNNs的性质及其在脊髓中的作用，可以找到针对性去除PNNs的替代性和非侵入性治疗策略，以增强损伤后的功能恢复。
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