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如何对显微照片染色区域定量分析?

 井里的怪兽 2021-03-24

最近,交流群(QQ群号:154447756)有童鞋问怎么计算显微镜照片的染色区域的面积,其实,在之前《如何用ImageJ测量图片不规则区域面积?》一文已向大家介绍了如何用ImageJ进行不规则区域(叶片病斑面积,划痕实验的划痕区域)的面积计算。文中照片中的叶片经过脱色处理,背景非常干净透明,与病斑能很好区分。

但是,如果切片(如下图)的染色区域和背景颜色区分度不是很高,上文的方法就不适合了。示例图片来自 https://imagej./ij/index.html,为天狼星红染色的小鼠肝组织切片,目的是对胶原纤维(collagen)进行性定量分析。

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那么,这样的图就没法计算了吗?可以计算。今天,就为大家介绍如何利用色彩“通道”和“阈值”实现染色区域与背景的区分,进而计算染色区域的面积。

首先,通过File \ Open打开需要分析的图片,如下图。

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接下来将图片的像素尺寸(pixels)换算为实际的物理尺寸,如这里的微米。方法是根据照片中的尺子,用直线工具画一条已知长度的线段(图片缩放:选择“放大镜”工具,左键放大,右键缩小;或者用ctrl键配合“+”“-”号实现放大和缩小)。

然后通过 Analyze\ Set Scale,设置换算关系,选择“Global“(在打开别的图片时可直接用该设置),点OK 完成设置。注意,虽然这里输入的是“um”,但imageJ会自动转换为“µm”,这一点非常人性化!

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由于染色部分和背景区分得不是“很开”,这里不能直接转为黑白图片,我们需要利用RGB的红绿蓝三个通道中的一个将染色区域与背景分开。

有两种方法:第一种方法是通过菜单栏的 Image\ Type \ RGB Stack 将图片分成3个颜色通道的灰度图,拖动滑块进行3个通道图片的切换。也可以通过 ImageStacks>Make Montage 同时显示展示3张图,如下。

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第二种方法是通过菜单栏的 Image \ Color \ Split Channels直接“炸开”成独立的3张图片,如下图,我个人更喜欢这种方法。通过比较3张图片,我们发现绿色通道(green)的颜色信息更“黑白分明”,其中黑色区域为目标区域。这时,另外两个颜色通道图片就可以“X”掉了!

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软件对图片的判别方法其实很简单,即黑色区域为“计算区域”,白色区域为背景,不纳入计算。这时我们会发现照片中的标尺是黑色的,计算面积时也会计算在内,我们这里就需要将标尺用白色“抹掉”。方法是绘制矩形区域,按回格键Backspace(Mac按Delete键)填充白色,如下图。

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注意与Photoshop软件不同的是这里填充的是背景色,双击“滴管”图标进行颜色设置,方法如下。

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然后通过 Image \ Adjust \ Threshold,手动调整阈值,手动调整染色区域的范围。

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红色区域正好覆盖到染色区域后,通过 Analyze \ Set Measurements 设置需要在结果窗口中显示的分析内容,比如这里勾选“Area”(面积),“Area Fraction(面积占比)”, “Limit to Threshold(阈值限制)”和 “Display Label(显示图片名称)”。

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然后按 “m”键 (或通过菜单Analyse \ Measure)完成计算, 示例图片的染色区域面积(area)为18676.521平方微米,在 Results窗口可以通过File\ Save As将数据导出为制表符分隔的文本文件。

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如果想要计算图片中局部区域的面积该怎么办呢?在灰度图状态下,用画笔或选区工具将不需要计算的区域“涂抹”成白色,而一定要计算的区域涂成黑色,用上述方法进行计算即可。此外,之前叶片病斑面积的计算理论上也可以用此方法,大家不妨试一下。

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