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本文由静子编译，董小橙、江舜尧编辑。 导 读 人类肠道中存在着数以千计的肠道菌群，这些菌群在消化以及宿主代谢中扮演着重要的角色，并且可以影响代谢疾病的发展，包括肥胖和二型糖尿病。肠道菌群代谢可与机体相互作用，改善代谢疾病的一些机制已经被阐明。已经有研究证实短链脂肪酸（SCFA），支链氨基酸或胆碱代谢在机体内的重要性。胆汁酸转化是肠道菌群的另一个重要的代谢物，对机体代谢具有重要的影响，并且在代谢性疾病和炎症性疾病中胆汁酸干预已经显现出巨大的治疗潜力。临床上口服胆汁酸在治疗原发性胆汁酸合成患者中很常见，但其对于肠道菌群的影响尚不清楚。脂肪来源已被证实会影响宿主代谢和饮食诱导的肥胖的都肠道菌群依赖性表型。例如无菌（GF）小鼠对于高脂饮食（HFD）诱导肥胖的易感性，取决于给予动物的HFD中的脂肪来源。 目前的研究对于胆汁酸和饮食中脂肪来源与肠道菌群和宿主之间的相互作用知之甚少，因此本研究的主要目标是确定肠道菌群在调节饮食胆汁酸补充对小鼠代谢状态影响方面的重要性，并通过使用不同来源脂肪的HFD引起的代谢变化下研究这些相互作用的适应性。 论文ID 原名：The gut microbiota drives the impact of bile acids and fat source in diet on mouse metabolism 译名：肠道菌群是食物中胆汁酸和脂肪影响小鼠代谢的内驱力 期刊：Microbiome IF：9.133 发表时间：2018年 通信作者：Thomas Clavel 通信作者单位：德国慕尼黑工业大学弗赖辛校区食品与营养科学研究中心 实验设计 1、动物实验设计 如图1所示，在小鼠8周龄的时候喂食对照饮食（CD）（CD的成分如表1所示）。适应该饮食两周后，将小鼠随机分为4个喂食组（n=9-12）,4种不同饮食的成分展示在表1中。（I）CD组；（II）CD+0.1%（w/w）胆汁酸和0.1%鹅脱氧胆酸（BA组）；（III）48KJ%来自棕榈油+BA（PHB组）；（IV）48KJ%来自猪油+BA（LHB组）。 在该实验喂养期结束时，将小鼠禁食6小时。测量尾静脉的空腹血糖水平后，处死一半小鼠;另一半用于口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。灌胃给予每公斤体重2g葡萄糖。灌胃后0,15,30,60和120 min尾静脉采血测量血糖水平，并计算每只动物的血糖水平曲线下面积（AUC）。 图1 动物实验设计摘要图 表1 本研究所使用的4种饮食成分表 2、样品收集 I、收集并称量附睾，肠系膜和腹股沟的白色脂肪（WAT），三者的重量称为白色脂肪重量（WAT mass）。 II、 用无菌管收集肠内容物或者来自不同肠断的组织，并且立即用液氮冻存。 III、收集肝脏及其他组织，并立即用液氮冻存 3、血清胰岛素和瘦素测定 4、肝脏病理学检查 5、胰高血糖素样肽1（GLP-1）和嗜铬粒蛋白A（ChgA）的免疫组化染色 6、qPCR分析肝脏mRNA表达 7、 肝脏甘油三酯含量测定 8、脂肪酸分析 9、甘油磷脂和胆固醇分析 10、胆汁酸含量测定 11、定量短链脂肪酸（SCFA） 12、肠道菌群培养 13、DNA提取 14、16S rRNA基因-靶向PCR 15、高通量16S rRNA基因扩增子分析 16、转录组学分析 17、统计方法 实验内容 1 代谢状态取决于膳食脂肪来源和肠道微生物的存在 作者首先研究小鼠在不同饮食情况下的代谢状态。无论是否补充BA或脂肪，SPF组的体重明显高于GF组，并且在喂养HFD后，SPF组小鼠的体重均明显上升，而GF组的体重则没有明显变化（图2a）。相当有趣的是，给予猪油后SPF组小鼠增加的白色脂肪的大小以及重量均显著高于棕榈油补充饮食的SPF组小鼠（图2b），并且白色脂肪的重量随着体重的增加而增加，PHB增加速率高于LHB（图2c）。作者采用OGTT实验研究白色脂肪增加对于机体代谢状态的影响，结果表明，相比较于PHB组，LHB喂养的SPF小鼠葡萄糖耐受受损；并且与体重增加相似，GF组的葡萄糖耐受量并没有受到饮食的明显影响（图2d）。 肠道细胞（EEC）产生的肠促胰岛素激素可影响葡萄糖耐量和胰岛素的分泌，并且GLP-1是由下胃肠道上皮肠内分泌细胞产生的，因此定量各组小鼠结肠中GLP-1阳性细胞数和EEC中嗜铬粒蛋白A（ChgA）的数量。从图2e中可以看出PHB补充饮食的SPF小鼠GLP-1阳性细胞的数量和总EEC的数量显著增加，但是LHB组，BA组以及CD组均没有显著变化。以上结果表明在肠道菌群存在的情况下，猪油和BA补充饮食会使得机体代谢受损。 图2 实验喂养和微生物定植对小鼠代谢的影响。a 最终体重（喂养8周后即小鼠18周龄）。b 所有组的WAT质量和从PHB喂养和LHB喂养的SPF小鼠收集的不同部位脂肪的代表性图片。c WAT质量和体重的回归分析。d OGTT期间的血糖浓度与曲线下面积。颜色代表的意义：CD，黑色; BA，红色; PHB，深蓝色; LHB，青蓝色。形状代表的意义：GF-菱形; SPF-三角形。e来自不同饲养组SPF小鼠结肠组织切片中胰高血糖素样肽（GLP）1-阳性细胞的定量。（为了空间和适当的图像尺寸，CD和BA的图片未显示，但相当于LHB组）箭头表示GLP1阳性的细胞。黑条表示100μm。 2 猪油可改变小鼠的脂质轮廓 相比较于CD组和BA组，无论是猪油还是棕榈油饮食组，SPF组和GF组小鼠的肝指数均下降，表明HFD和BA补充饮食可降低小鼠的肝指数，这种现象与脂肪来源没有关系（图3a），并且这种降低涉及了小鼠体重的增加以及肝脏指数的减轻。与体重增加相似的是，SPF组在不同的饮食情况下，肝脏甘油三酯的浓度均高于GF组，但是只有LHB补充饮食会使得SPF小鼠肝脏甘油三酯含量显著高于GF小鼠（图3c）。为了精确表明图2中猪油导致的代谢作用的特定变化，测定PHB和LHB饮食的SPF组和GF组小鼠的肝脏脂质轮廓。SPF组的总脂肪酸在喂养PHB后高GF3.3倍，喂养LHB后高1.7倍，但是两种HFD饮食的情况并没有显著差别。对比GF小鼠，SPF小鼠的由PHB饮食诱导的脂肪酸组成变化幅度更大，LHB喂养导致更高比例的单不饱和脂肪酸，特别是油酸（FA18：1 n-9）和较低比例的多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸（FA20：4n-6）（图3c）。 肝脏脂肪酸主要被酯化成细胞膜脂质和甾醇，因此作者分析了甘油磷脂、鞘脂和胆固醇酯（CE）在PHB和LHB喂养中的变化情况。脂肪来源显著影响SPF小鼠中总磷脂酰胆碱（PC）和CE的水平。相比较于GF小鼠，SPF小鼠喂养LHB后总CE显著升高1.8倍，包括较高比例的CE16:1和CE18:1；而总PC显著降低，特别是PC36:2和PC36:4（图3d）。喂养两种HFD饮食导致SPF小鼠和GF小鼠肝脏中的脂质轮廓不一样，因此测定与长链脂肪酸转运相关的基因Cd36。与GF组的Cd36在两种HFD饮食中没有显著性差异相反，SPF组的Cd36在PHB组中升高10倍，LHB升高2倍（图3e）。脂质分析也包括定量分析血液中的胆固醇和胆汁酸。如表2所示，SPF小鼠中LHB喂养后TCDCA相比较于PHB组显著升高。但是胆固醇的水平不管是饮食还是肠道菌群定植都没有影响。本部分的结果表明小鼠的代谢状态与LHB喂养有关并且会显著影响脂质轮廓。 图3 肝脏脂质谱的调节 a 肝脏与体重的比值。b 甘油三酯含量。c在禁食小鼠中测量脂肪酸的总量，组成和分布（如图中所示，n = 4-7）。d 脂类和物种的改变。总量的> 1％的脂质用于统计分析。颜色表示的意义如图1所示。SAFA：饱和脂肪酸，MUFA：单不饱和脂肪酸，PUFA：多不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸，PC：磷脂酰胆碱，CE：胆固醇酯。e Cd36基因在mRNA水平上在小鼠肝脏中的相对表达。 表2 空腹小鼠血浆胆汁酸和胆固醇的含量 3 膳食脂肪和胆汁酸补充剂调节小鼠盲肠微生物群 GF小鼠中观察不到饮食对于小鼠代谢状态的影响，表明肠道菌群定植至少部分反映了所观察到的变化，因此分析肠道菌群的结构和功能。 微生物结构 GF小鼠和SPF小鼠最主要的差别是在SPF小鼠的盲肠重量显著降低（图4A），但是BA补充饮食是否会影响盲肠的重量并未有人研究。如图4a所示胆汁酸显著降低GF小鼠和SPF小鼠盲肠的重量，HFD喂养后会加重这种降低。厌氧培养表明GF小鼠中确实没有微生物的存在，并且16sRNA分析也证实这一点（图4B和C）。厌氧培养还表明不同的饮食条件并不会影响SPF小鼠盲肠中的微生物总数。 图4 SPF小鼠和GF小鼠肠道菌群定植的状态 A 盲肠和体重的比值 B 通过厌氧培养定量的活菌数量 C 来自GF和SPF小鼠的盲肠内容物DNA的16S rRNA基因靶向PCR测定。1.5 kbp表示肠道菌群的存在。水用作阴性模板对照（NTC） 相比较于CD和BA补充喂养，LHB喂养会显著增加肠道菌群的丰度，PHB喂养则没有这种现象（图5a）。BA补充喂养虽然不会影响肠道菌群的丰度，但是Shannon有效计数显著降低，这表明优势物种分布的均匀性发生了变化。β多样性分析显示饮食与肠道菌群的聚类相关（图5b）。饮食诱导的肠道菌群组成的改变在家族水平上被清楚的展现出来：饮食实验组（BA，PHB，LHB）显著提高Desulfovibrionaceae菌株，而在这三个组别中并未检测到Erysipelotrichaceae菌株；PHB组的Lachnospiraceae菌株的相对丰度相比较于LHB增加了15%；相比较于CD组，LHB组的Ruminococcaceae菌株相对较高；而比起其他两组，PHB和LHB组的Rikenellaceae菌株相对丰度显著降低（图5c）。 在单个分子种类的水平上利用操作单元（OTUs）聚类分析发现四种饮食的肠道菌群表现不一样。CD喂养中Erysipelotrichaceae科和Faecalibaculum rodentium科特异性存在，而BA补充饮食则Alistipes 种和Muribaculum 种比例相对较高，PHB补充饮食中相对丰度最高的是Acetatifactor muris，而LHB中存在的Oscillibacter ruminantium则检测不到。LHB饮食中比例较高的则是Clostridium lactatifermentans和Flintibacter butyricus（图5d）。 图5 饮食诱导的盲肠肠道菌群特征变化。a 阿尔法多样性显示为丰度和Shannom有效计数。b 通过广义UniFrac距离的多维尺度分析进行β多样性分析。p值由PERMANOVA获得，用于测试样本组之间分离的重要性。c 肠道菌群科层面显著改变的分类群的箱形图。d 不同饮食组特定OTU的相对丰度。使用EzTaxon对OTU序列（V3 / V4区的约450bp）进行分类。每个OTU的相对丰度范围在相应的OTU标识号旁边的方括号中给出。 微生物功能 胆汁酸和脂肪来源的不同均会影响盲肠肠道菌群的结构，因此我们进一步分析肠道菌群的功能是否会不同。 采用菌群转录组学分析22只空腹小鼠（CD，n=7；BA，n=4；PHB，n=7；LHB，n=5）的盲肠内容物。饮食摄入对于肠道菌群的活性产生实质性的影响：依据小鼠盲肠中肠道菌群基因表达的主要聚类可根据HFD饮食摄入区分（图6a）。根据小鼠中观察到的代谢表型来进一步分析两种HFD饮食所造成的不同影响，LHB和PHB中266个基因在不同水平上有差别（图6b）。相比较于LHB，PHB中醚类脂质代谢（map00565），自噬（map04138）和半乳糖代谢（map00052）的基因表达较高（图6c），在醚类脂质代谢（map00565）通路进行单个KEGG直系同源组别（KO）分析，PHB中蔗糖磷酸化酶[K01058]和红细胞糖苷α1, 3-N 乙酰半乳糖氨基转移酶1（GBGT1）[K01114]更普遍存在。另一方面，15种功能类别的肠道菌群在LHB中具有更高表达，包括脂肪酸生物合成（map00061），氨基酸代谢（丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，map00250;精氨酸生物合成，map00220; D-丙氨酸）代谢，map00473;精氨酸和脯氨酸代谢，map00330;赖氨酸生物合成，map00300;牛磺酸和亚牛磺酸代谢，map00430;β-丙氨酸代谢map00410）和硫代谢（map00920）（图6c）。 图6 饮食诱导的小鼠盲肠微生物群的转录组转变。a 四种饮食之间具有差异表达水平的1207个基因的热图。b PHB组和LHB组之间266个基因差异表达水平的热图。c 两种HFD之间的表达水平差异显着的主要代谢途径 讨 论 本研究的主要目的是测定肠道菌群对于小鼠饮食中的胆汁酸和脂肪来源的代谢反应的功能影响。尽管无菌小鼠似乎收到保护，但当饮食中含有主要胆汁酸和猪油来源的脂肪时，肠道菌群定植的小鼠代谢紊乱，并且其肠道菌群特征明显。 肠道菌群移植及其宿主代谢 本研究中发现无菌小鼠的体重相比较于对应的肠道菌群定植小鼠的体重较低，这与Bäckhed F的研究结果一致。并且肠道菌群可改变肝脏那个脂质代谢：肠道菌群移植会升高肝脏中甘油三酯和总脂肪酸的含量，肠道菌群定植小鼠中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的比例高表明其脂肪酸合成增加。肠道微生物群会影响宿主的脂质代谢，但肠道微生物与膳食脂肪来源之间的相互作用最近才得到强调。我们的研究证实了含有动物或植物脂肪饮食对于脂质代谢的影响依赖于肠道菌群。和其他文献结果符合，无菌小鼠给予主要胆汁酸后TCDCA的含量较高。 主要胆汁酸补充饮食改变宿主代谢和肠道菌群结构 Zheng等报道单独补充胆汁酸会加重代谢紊乱，与HFD的作用相似，包括增加体重，脂肪组织，高胆固醇血症。但是本研究和Watanebe等人的研究都没有观察到胆汁酸的这种作用。不同研究的方法学差异可以解释这种差异，包括补充的胆汁酸的类型和剂量（例如，在本研究采用0.2％游离的原始胆汁酸，Zheng等人使用0.1％结合胆酸），遗传小鼠的背景，或小鼠在喂养开始时的年龄（3周龄时男性C57BL / 6J与10周龄时男性C57BL / 6N）。 只有少数研究评估了胆汁酸诱导的肠道微生物群变化，研究结果似乎与研究有关，很可能是由于不同的实验方案和实验开始时小鼠的肠道菌群移植状态不同。Islam等人在显微镜计数、克隆文库和原位杂交方面研究发现约0.2%胆酸对于大鼠盲肠肠道菌群的影响。Islam等人研究发现Shannon有效计数和细胞计数下降，而Lachnospiraceae和Erysipelotrichaceae比例增加。本研究则发现单独的胆汁酸饮食补充虽然也降低Shannon有效计数，但没有检测到Erysipelotrichaceae，并且相比较于CD组，除PHB组外，BA和LHB组的Lachnospiraceae相对丰度较低。在另一项研究中采用体外底物放射性标记法，发现喂养1%胆酸可以增加肠道菌群的密度从而增加其通过7-α-脱羟基作用产生二级胆汁酸脱氧胆酸的能力。通过16S rRNA扩增序列，本研究并未发现产生二级胆汁酸的肠道菌群的种类的显著增加。Desulfovibrionaceae科（在Deltaproteobacteria纲内）的相对丰度随着胆汁酸补充而增加。其他文献也发现Desulfovibrionaceae在肥胖和代谢受损的小鼠中相对丰度显著增加。 饮食中脂肪来源影响宿主代谢 Kübeck等人最近报道说与喂食含棕榈油的HFD的小鼠相比，喂食含猪油的HFD的无菌小鼠对饮食诱导的肥胖具有抗性，部分原因是能量消耗增加。有趣的是，不管是含有棕榈油或者是猪油的HFD饮食，喂食HFD的无菌小鼠在本实验中并没有显着增加体重，尽管本实验的饲喂期与Kübeck等人相似（8周）。这个结果表明如果在Kübeck等人的HFD饮食中加入初级胆汁酸可预防喂养含棕榈油的HFD饮食的无菌小鼠的肥胖发展。这一设想符合Watanabe等人2006年的研究结果。Watanabe等人认为给常规C57BL / 6J小鼠喂食长达7周的0.5％（w / w）胆酸可诱导能量消耗，从而抵消高脂肪饮食引起的体重增加。尽管Watanabe等人未提供关于脂肪来源的信息，但喂食HFD和胆汁酸的肠道菌群定植小鼠与食物对照组小鼠一样瘦。然而，在我们的实验中，仅在无菌的小鼠中观察到这种现象，而SPF小鼠喂食含有BA和HFD饮食的小鼠与对照或仅含有BA饮食的小鼠相比，体重显着增加。 肠促胰岛素激素胰高血糖素样肽1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）是决定胰腺葡萄糖耐量和胰岛素分泌的重要因素。GIP和GLP-1在肠道中显示出不同的表达模式，GIP在近端小肠中产生，而GLP1在小肠的远端部分和在结肠中产生。在本研究中，定量小鼠结肠切片中GLP1和ChgA阳性细胞的数量表明，与所有其他饮食相比（包括PHB组），LHB喂养与产生GLP-1的EEC显着增加相关。LHB小鼠结肠中未改变的EEC数量与Beyaz等人公布的数据一致。Beyaz等人认为猪油喂养的60％-kcal高脂肪饮食的小鼠空肠中ChgA阳性细胞没有变化。本研究结果还表明不同的脂肪来源促进L细胞分化的能力也不一样，PHB喂养的小鼠结肠中产生GLP1的ECC数量的增加可能有助于改善葡萄糖耐量。 饮食中脂肪来源影响肠道菌群 来自盲肠的16S rRNA基因扩增子测序定量禁食的SPF小鼠肠道菌群的含量显示饮食诱导肠道菌群多样性和结构的变化。比较两种不同的HFD时，PHB增加了Lachnospiraceae的相对丰度，包括一个与Aceta tifactor muris有92.6％的相似性的特异的OUT。该物种相对于本研究的OTU是最近的物种，但其序列同一性低于属级阈值。其他研究报告在饮食诱导的肥胖的情况下A.muris会发生变化。这些细菌在宿主代谢中的多样性和作用值得进一步研究。LHB喂养后相对丰度较高的两个OTU在物种水平上被鉴定为Clostridium lactatifermentans和Flintibacter butyricus。前一种是乳酸发酵细菌，产生短链脂肪酸乙酸酯和丙酸酯；后一种物种能够从氨基酸中产生丁酸盐，其本研究通过转录组学和之前的一项研究中发现其代谢似乎受到HFD的影响。尽管如此，在小鼠的结肠内容物中没有观察到结肠中SCFA水平的差异。HFD饮食也在功能水平上影响小鼠盲肠的肠道菌群，因为转录组学方法确定脂肪来源所影响的基因和途径。参与醚脂代谢基因的表达在CD组和PHB组之间是相似的，但在LHB组中显着更高。乙醚脂质水平的变化与宿主代谢状况有关，包括非酒精性脂肪性肝炎，高血压，肥胖和1型糖尿病。 评 论 本研究表明脂肪来源的不同可以显著影响饮食诱导的肥胖小鼠的模型的表型，因此在解释饮食诱导的肥胖模型数据时需谨慎阐明所使用饮食中脂肪来源的影响。猪油和胆汁酸的补充饮食对于肠道菌群定植小鼠的代谢是有害的，而对无菌小鼠无明显影响表明肠道菌群参与这种作用，并且肠道菌群的组成和功能受到两种脂肪来源不同的高脂饮食的影响。 |
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