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编译：永稷，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 多个国家食物传播病害的爆发以及单核李斯特菌对苹果和苹果产品的污染警示人们需要加强对苹果供应链中的病原物的控制。苹果加工设备已被认为是单核李斯特菌污染的潜在来源。本研究旨在探索苹果和其他水果加工环境中微生物的组成以及其与食物传播病原菌单核李斯特菌发生的关系。对三个苹果及其他水果加工设备中收集到的117个样品进行分析，结果表明：设备F2中的单核李斯特菌显著高于设备F1和F3。细菌和真菌分类多样性指数Shannon在设备F2中显著低于设备F1和F3，说明设备F2中的微生物与设备F1和F3有所不同。在设备F2的微生物中独特的细菌为荧光假单胞科，真菌为耶罗威亚酵母科。在所建立的食品加工环境中的微生物和真菌的组成及其多样性可能诱导了单核李斯特菌的出现。这些发现为更进一步研究微生物群落在单核李斯特菌形成中的作用以及对苹果供应链当中的单核李斯特菌的防控策略优化奠定了理论基础。 论文ID 原名：The occurrence of Listeria monocytogenes is associated with built environment microbiota in three tree fruit processing facilities 译名：单核李斯特菌的出现与三个苹果加工设备中的环境微生物相关 期刊：Microbiome IF：10.133 发表时间：2019年7月 通信作者：Jasna Kovac 通信作者单位：宾夕法尼亚州立大学食品科学系和微生物中心 实验设计 1.三个苹果加工设备（F1、F2和F3），每个设备3个采样点，每个设备进行13次采样，共117个样品； 2.对117个样品进行扩增子测序：细菌16S rRNA、真菌ITS2； 3.进行OTU聚类，并使用R语言对微生物群落进行α-多样性和β-多样性分析； 4. 基于每个单独加工设备以及三个共同加工设备中微生物科级物种进行网络分析。使用Pearson和spearman相关、交互信息、Bray-Curtis和Kullback-Leibler不同相似性指数确定特定科级菌种的共现。Row-shuffle随机化和自展方法被用于去缩小组成所诱导的错误相关。所得p值采用Brown方法合并，benjamin - hochberg多重比较校正法进行校正。使用yfiles布局算法插件应用程序可视化交互。 5. 基于Greengenes 和 SILVA数据库，运用PICRUSt进行微生物群落功能分析。 结果 1 三个设备所收集的样本中单核李斯特菌的丰度差异 总共收集117个样本，可以从其中的39个样本中分离得到单核李斯特菌，其中设备F1中11个，设备F2中39个，设备F3中16个。设备F2中李斯特菌的阳性率为100%，设备F1的阳性率为28%，设备F3的阳性率为41%，三个设备之间单核李斯特菌的阳性率之间差异显著，但是与洗涤、风干和上蜡部分相比，没有显著差异。 2 扩增子序列分析及OUT聚类 对16S rRNA和ITS2序列进行两次排序，从16S rRNA序列中最终得到最小、中间和最大数量的总OTUs分别为：4501、 28,056和168,219。从ITS2序列中得到最小、中间和最大数量的总OTUs分别为5323、17,882和350,415。利用代表序列样本大小的OTU数量与代表物种丰富度的独特OTU数量绘制稀疏曲线。三个设备总体上具有相似的序列样本大小，但是设备F2与F1和F3相比较，会在较少的序列中达到饱和，可见设备F2中微生物多样性较低。ITS2聚类分析结果表明：设备F2中的样本分类大于设备F1和设备F3样本。设备F1和设备F3样本的稀疏曲线未达到饱和，说明大量低丰度分类的微生物多样性在已有的测序结果中还未被发现。 3 三个设备样品中微生物群落多样性分析 采用主坐标图对设备之间的细菌群落多样性进行β-多样性可视化。结果发现：主成分PC1和PC2分别可表示细菌群落中10.7%和6.6%的变化，可表示真菌群落中43.1%和20.5%的变化。设备F1和F3之间的微生物群落相似性高于它们与设备F2的相似性。与微生物群落不同的是，设备F1和F3之间的真菌群落相似性较低。为了更进一步的对主坐标分析图中微生物群落之间的差异进行研究，需要运用PER-MANOVA数据统计方法对三个独立设备中微生物的分类组成进行研究。 成对非参数多元分析表明：设备微生物群落之间存在显著的不同。采用成对非参数多元分析方法来对设备之间的潜在差异进行统计学评价。结果表明：微生物群落的组成在月份之间没有显著的变化。但是，不同设备以及不同加工流程对微生物群落的组成由显著的影响。真菌群落组成在不同设备之间差异显著，但是在月份之间却显著差异。此外，对不同加工流程中的样本进行比较，发现冲洗和风干以及风干和上蜡之间没有显著不同。但是，真菌群落在冲洗和上蜡之间差异显著。为了对设备F2样品中的微生物群落差异性进行解释，我们对来自不同设备中样品的微生物分类学进行研究。结果表明：设备F1、F2和F3中分别具有12、8和14个独特的科。其中，设备F1中高丰度的微生物分别为：黄杆菌科Flavobacteriaceae (19.68%)、莫拉氏菌科Moraxellaceae (11.93%)和 Weeksellaceae (10.27%)。设备F2中高丰度的微生物为荧光假单胞菌(41.97% RA)；设备F3中高丰度微生物分别为Weeksellaceae(13.22%)、黄杆菌科Flavobacteriaceae(11.45%)、伯克氏菌科Burkholderiaceae（8.67%）和莫拉氏菌科Moraxellaceae（8.67%）（图5）。在设备F2中的荧光假单胞菌丰度较高，同时单核李斯特菌的发生率也是最高的。设备F2中荧光假单胞菌的丰度显著高于设备F1和F3，设备F1和F3之间无显著差异。设备F2中丰度较高的菌株还有黄杆菌，但是黄杆菌在设备F1和F3中也较高（图6）。我们进一步在科水平上对真菌群落的差异进行了研究，结果表明：设备F1中丰度较高的分别为金黄色葡萄球菌科Aureobasidiaceae (30.04%)、曲霉科Aspergillaceae (12.69%)和大疱担子科Bulleribasidiaceae。设备F2中丰度较高的分别为耶罗威亚酵母科Dipodascaceae (56.08%)、毛孢子菌科Trichosporonaceae (10.88%)和曲霉科Aspergillaceae (4.52%)。设备F3中丰度较高的分别为：毛孢子菌科Trichosporonaceae (30.63%)、金黄色葡萄球菌科Aureobasidiaceae (18.2%)和孢腔菌科Pleosporaceae (9.9%)。耶罗威亚酵母科Dipodascaceae在设备F2中丰度更高，在设备F1和F3中丰度较低。相反，金黄色葡萄球菌科Aureobasidiaceae在设备F2中的丰度较低，在设备F1和F3中的丰度较高（图7）。 4 假单胞菌科，肠杆菌科，根瘤菌科的共表达网络分析 为了更进一步对不同微生物种类之间的关系进行分析，尤其是设备F2中高丰度的菌株，采用网络分析来对苹果加工包装环境中微生物的共发生和共排除关系进行研究。由于设备F2中单核李斯特菌的发生率最高，且假单胞菌丰度相对较高。所以我们通过表达网络来对微生物群落与假单胞菌之间的关系进行评价。对所有设备中的所有样本及各个设备中的样本中假单胞菌的共发生和共排除作用进行研究，以缩小设备之间显著的微生物组成差异所造成的影响。设备F1中假单胞菌科仅与肠杆菌科、肠杆菌科共同发生，它们与根瘤菌科的发生呈正相关。设备F2样本之间未发现与假单胞菌的共发生和共排除关系。设备F3中根瘤菌科Rhizobiaceae、Arcobacteraceae、Paludibacteraceae和未知真菌Parcubac-teria与假单胞菌共生。所有样本之间的分析也发现相似的关系。在共生网络中，假单胞菌与根瘤菌科Rhizobiaceae、肠杆菌科Enterobacteriaceae和念珠菌科Dysgono-monadace显著正相关共生，与无毛螺旋体科Spirosomaceae和蛭弧菌科Bdello-vibrionaceae之间共排除。 5 基于16S rRNA标记基因，采用PICRUSt法对菌株功能进行预测 PICRUSt预测与设备F1和F3相比，设备F2中不同丰度细菌的功能。首先按设备对功能类群进行分组。发现设备F2微生物样品在各功能类群中呈现较高的丰度。由于代谢类别、环境信息过程以及细胞过程在本实验样品中呈现出更高的丰度，所以分别对三个功能类别进行分类。设备F2与设备F1和F3微生物的代谢功能之间存在显著差异，而设备F1和设备F3之间无显著差异。环境信息过程类别中设备F2丰度更高。 讨论 尽管单核李斯特菌不能在苹果中生长，但是该病原真菌可以在新鲜的水果表面存活。鉴于苹果可以生吃，它们一旦被单核李斯特菌所污染，就会对老人和免疫功能缺失的特殊消费群体的身体健康产生危害。本研究对苹果收获及加工过程中单核李斯特菌的污染来源及其发生机制进行研究。研究发现：设备F2中单核李斯特菌发生率较高的原因可能是：设备F2中未安装掉落物收集盘来收集加工过程中的水和有机物质，从而为微生物的生长提供了适宜环境。设备F2位于设备F1和F3之间，使得卫生清洁较难，卫生条件差，从而促进单核李斯特菌污染以及微生物生物膜的形成。通过微生物组学对这一现象进行深入阐述，发现单核李斯特菌发生率高的设备F2中微生物群落丰度较低，有效减弱了微生物之间的营养竞争，从而为单核李斯特菌的发生提供了有利的生长环境。同时，设备F2中高丰度假单胞菌的出现，充分说明假单胞菌通过形成生物膜来提高单核李斯特菌的抗逆性；高丰度酵母菌的出现，充分说明设备F2卫生状况较差是单核李斯特菌发生的又一原因。在假单胞菌和酵母菌这两株污染指示菌的基础上，我们应用网络分析来描述假单胞菌科与其他细菌科之间的共发生和共排除关系进行研究，从而深入阐述了单核李斯特菌在苹果包装箱环境中的生存和持久性。假单胞菌网络分析表明：在设施2的环境中，肠杆菌、假单胞菌和根瘤菌科同时出现，因为它们由于易于遗传物质交换而相互关联。相反，当对所有样品进行分析时发现，假单胞菌和蛭弧菌科之间发生共排除现象。酵母菌网络分析表明该真菌与其他大多数真菌之间发生相互排斥作用，与一个未命名的真菌之间发生共存关系。最后，对设备F2中微生物群落的进行功能预测，发现微生物群落功能主要与代谢、环境信息过程以及细胞过程相关。 评论 该文章基于扩增子序列，对117个试验样本之间的差异进行了深入挖掘，阐明了食品传播病害的来源以及病原真菌的生存机制，为进一步进行病害防控奠定了理论基础。特别需要注意的是，该文章以较大的实验样本，对扩增子序列分析流程进行了全面细致的分析，从而达到对科学问题的阐述，值得参考。
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